[發(fā)明專利]一種降解蛋白質(zhì)的基因重組釀酒酵母及構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510362986.1
• 申請(qǐng)日: 2015-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN105154346B
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 席北斗;黃彩紅;何小松;高如泰;袁英;趙昕宇;黨秋玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12N15/57;C12R1/865
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 宋焰琴

一種降解蛋白質(zhì)的基因重組釀酒酵母，含有外源蛋白酶基因。本發(fā)明還公開了上述基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法。本發(fā)明的基因重組釀酒酵母是通過對(duì)蛋白酶基因進(jìn)行密碼子改造，與釀酒酵母表達(dá)載體重組并轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞，獲得正確的表達(dá)構(gòu)建而成。該基因重組釀酒酵母有效地提高了酵母細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的降解效率，且具有生產(chǎn)成本低、生物量可重復(fù)利用、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，對(duì)環(huán)境領(lǐng)域蛋白類物質(zhì)的降解、工業(yè)領(lǐng)域蛋白酶的規(guī)模發(fā)酵與生產(chǎn)具有積極的推動(dòng)作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地公開了一種高效降解蛋白的基因重組釀酒酵母。

本發(fā)明還涉及上述基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法。

本發(fā)明還涉及上述基因重組釀酒酵母在降解蛋白質(zhì)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物蛋白酶具有來源廣、成本低等優(yōu)勢(shì)，在工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。絲氨酸蛋白酶是最常見的一類蛋白酶，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、釀造等行業(yè)，具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前研究主要集中于產(chǎn)酶菌株的篩選、酶學(xué)性質(zhì)研究和產(chǎn)酶基因片段的克隆等方面，提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及穩(wěn)定性、擴(kuò)大其應(yīng)用范圍是工業(yè)化生產(chǎn)中亟待解決的主要問題。基因工程技術(shù)為該問題的解決及該酶的應(yīng)用改造提供了平臺(tái)。

釀酒酵母是工業(yè)化發(fā)酵的常見菌種，生物安全性高，其表面展示系統(tǒng)能夠使外源蛋白在細(xì)胞表面大量表達(dá)。細(xì)胞表面展示技術(shù)的原理是將外源肽以融合蛋白的形式固定在細(xì)胞的外膜，被表達(dá)的多肽可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，集表達(dá)、純化、固定于一體，在醫(yī)藥、食品、生物燃料、環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。截至目前，對(duì)于密碼子改造后的sub基因在釀酒酵母細(xì)胞外膜表達(dá)是否可以提高酶活性，國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種降解蛋白質(zhì)的基因重組釀酒酵母。

本發(fā)明的又一目的是提供一種上述基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的降解蛋白質(zhì)的基因重組釀酒酵母，含有外源蛋白酶基因。

本發(fā)明提供的上述降解蛋白質(zhì)的基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，步驟為：

S1、按照釀酒酵母密碼子偏愛性，改造蛋白酶基因編碼序列，合成該基因；

S2、將蛋白酶基因與釀酒酵母表面展示載體pYD1連接構(gòu)建重組表達(dá)載體；

S3、將上述構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EBY100中，構(gòu)建基因重組釀酒酵母。

本發(fā)明提供的的基因重組釀酒酵母可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的降解。

本發(fā)明的基因重組釀酒酵母有效地提高了酵母細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的降解效率，且具有生產(chǎn)成本低、生物量可重復(fù)利用、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，對(duì)環(huán)境領(lǐng)域蛋白類物質(zhì)的降解、工業(yè)領(lǐng)域蛋白酶的規(guī)模發(fā)酵與生產(chǎn)具有積極的推動(dòng)作用。

附圖說明

圖1是表達(dá)載體pYD1質(zhì)粒圖譜。

圖2是重組蛋白酶釀酒酵母轉(zhuǎn)化子菌落PCR鑒定。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明構(gòu)建了高產(chǎn)蛋白酶的基因工程菌，研究了其酶學(xué)特性，該工程菌可用于大量生產(chǎn)高純度蛋白酶，表達(dá)量高，成本低，應(yīng)用范圍廣，為蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一種新方法，為工業(yè)化大量生產(chǎn)該蛋白酶提供了技術(shù)參考，為油脂精深加工、生物能源等方面工業(yè)蛋白酶源的開發(fā)提供條件。

本發(fā)明提供的表面展示蛋白酶的重組釀酒酵母，通過在細(xì)胞表面表達(dá)蛋白酶，增大酶與底物的接觸面積，達(dá)到提高蛋白質(zhì)降解效率的目的。所述蛋白酶基因連接到載體pYD1，并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EBY100中。同時(shí)，對(duì)該酶特性進(jìn)行了分析。