[發明專利]一種石蒜屬植物外植體的消毒方法

有效

• 申請號: 201510362839.4
• 申請日: 2015-06-24
• 公開（公告）號: CN105028197B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 任梓銘;夏宜平;李岳;李丹青;畢波;張棟
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于植物快速繁殖技術領域，尤其涉及一種石蒜屬植物外植體的消毒方法。

背景技術

石蒜屬植物無菌播種體系的建立對其規模化生產繁育、雜交育種和良種選育及石蒜堿的提取具有重要意義。

石蒜屬植物的繁育研究多集中在無性繁殖，而種子繁殖是在不影響母鱗莖生長的前提下獲得觀賞植物花色及花型等自然變異的重要途徑。無菌播種較基質播種可以顯著提高種子萌發率、促進原生鱗莖發育及增殖，在短期內獲得大量無菌苗，這也是解決石蒜屬植物快速繁育問題的關鍵。

目前，關于石蒜屬植物無菌播種的報道十分有限。

姚麗娟(姚麗娟，楊燕萍，徐曉薇等.換錦花繁殖技術研究[J].北方園藝.2010(12)：83-85.)初步篩選出換棉花無菌播種的較適培養基MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，但試驗過程中出現污染的比例高達2/3。

而佘琳芳(佘琳芳.石蒜屬植物小鱗莖的繁殖技術及其化學調控研究[D].浙江大學，2014.)通過實驗證明無菌播種可以明顯提高種子繁殖系數(一粒種子最多獲得了7個小鱗莖)，但由于污染率過高，未能篩選出最佳培養基配方。

可見，石蒜屬植物尚未建立較為成熟的無菌播種繁育體系，這也在很大程度上限制了其規模化生產繁育、園林應用與推廣。

現在應用于石蒜屬植物無菌播種繁育體系中的消毒方法主要有：果皮燃燒法(佘琳芳.石蒜屬植物小鱗莖的繁殖技術及其化學調控研究[D].浙江大學，2014.)、次氯酸鈉浸泡法。但是都由于試驗中污染率過高而未能篩選出較優的無菌播種滅菌方法。

因此，如何有效地降低污染率成為了石蒜屬植物無菌播種技術的關鍵。

發明內容

本發明提供了一種石蒜屬植物外植體的消毒方法，該方法可顯著降低石蒜屬植物無菌播種過程中種子的污染率，減少細菌、真菌對種子的污染，且提高種子的萌發率。

一種石蒜屬植物外植體的消毒方法，包括：

從石蒜屬植物果實中取出種子，將所述種子表面消毒后置于溫水中浸泡，吸脹后取出，再置于升汞中進行渦旋振蕩離心處理，處理完成后漂洗干凈，獲得無菌外植體。

所述表面消毒的方法包括：將種子置于體積濃度為75％的乙醇中浸泡30～40秒。種子在浸泡前先進行表面消毒可以避免浸泡過程中表面細菌的滲入，降低種子的污染率。

將種子置于溫水中浸泡的目的在于使種子充分吸水吸脹以降低滲入種子內部的滅菌試劑的濃度，減小其對種子的傷害，從而保持種子活力。作為優選，所述浸泡的溫度為35～38℃，時間為5～6小時。

升汞作為常規的消毒試劑被廣泛應用于種子的消毒中，一般采用的質量濃度為0.1％。常規的消毒方法通常是將種子直接浸泡于升汞中進行消毒，并在短時間內取出種子，用清水多次沖洗種子，以避免升汞滲入種子中的濃度過高，傷害種子，降低種子活力。上述方法由于時間較短造成升汞只能對種子進行表面的殺菌，種子內部的消毒效果較差；想要提高消毒效果只能延長浸泡時間，但這又會造成種子活力的降低，影響后續的播種繁殖過程。

通常，內生菌較少的種子采用上述直接在升汞中短時浸泡的方式就可以實現種子的消毒，種子污染率較低；但是，石蒜屬植物種子是一種易受內生菌侵染的種子，采用上述直接在升汞中短時浸泡的方法進行消毒，種子的污染率仍然較高，所以上述常規方法不適用于石蒜屬植物種子。

實驗發現，先將種子進行溫水浸泡后，再將浸泡于升汞溶液中的石蒜屬植物種子連同升汞溶液一同進行渦旋振蕩，種子的污染率顯著降低；分析其原因可能是渦旋振蕩過程可以使升汞溶液短時間內快速滲入種子中起到殺菌消毒作用；由于渦旋振蕩時間較短，加上振蕩前已經對種子進行溫水浸泡處理，所以升汞不易對種子造成損傷，不會影響種子的活力。

作為優選，所述渦旋振蕩離心的頻率為2000～2500轉/分鐘；時間為8～10分鐘。

作為優選，浸泡完成后，先將吸脹的種子置于體積分數為75％的乙醇中進行表面消毒，再將消毒后的種子置于升汞中進行渦旋振蕩離心處理。所述表面消毒的時間為30～40秒。種子浸泡過程和升汞渦旋振蕩過程中間也應該進行消毒，可以進一步避免種子受到污染。

同樣，從石蒜屬植物果實中取出種子的過程也應該進行消毒，所以，所述石蒜屬植物果實的消毒過程包括：用表面活性劑浸泡石蒜屬植物果實，后用流水沖洗至無明顯泡沫，再用乙醇進行表面滅菌。

所述表面活性劑為吐溫或洗潔精。作為優選，表面活性劑浸泡的時間為15～20min。