[發(fā)明專利]一種真菌熒光染色的方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510361764.8
• 申請(qǐng)日: 2015-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN104894211A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周倩;劉甜甜;熊興耀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02;G01N1/30
• 代理公司: 長(zhǎng)沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光染色的方法，具體涉及一種真菌熒光染色的方法，同時(shí)還涉及該方法在觀察病原真菌入侵過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物病理學(xué)的研究中經(jīng)常需要觀察病原真菌與寄主植物的相互作用。傳統(tǒng)的組織透明染色法可以對(duì)組織中病菌菌絲擴(kuò)展進(jìn)行定量研究，揭示寄主和病原物相互作用的時(shí)空變化動(dòng)態(tài)。但是，該組織透明染色法的應(yīng)用具有一定的局限：首先，該法難以區(qū)分細(xì)胞的病理性壞死和機(jī)械創(chuàng)傷，會(huì)導(dǎo)致觀察結(jié)果不理想；其次，對(duì)于觀察真菌孢子在寄主植物表面的萌發(fā)和侵入的過程，該組織透明染色法無法實(shí)現(xiàn)。因?yàn)榻M織透明染色法在操作過程當(dāng)中需要反復(fù)漂洗，會(huì)將孢子洗脫下來。此外，該組織透明染色法具有操作耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。

觀察真菌孢子萌發(fā)入侵的過程中另一種經(jīng)常使用的方法是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將綠色熒光蛋白基因（GFP）轉(zhuǎn)化到病原真菌中，使該基因在病原真菌中表達(dá)，然后在熒光顯微鏡下觀察病菌的形態(tài)和活動(dòng)情況。該法能更準(zhǔn)確、快速地觀察病菌在寄主植物表面和組織中的行為，是研究病菌與其寄主之間的相互關(guān)系較為理想的方法。然而，該法涉及轉(zhuǎn)基因的操作過程，包括表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化等過程，耗時(shí)更長(zhǎng)，且對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，還有不少真菌的遺傳轉(zhuǎn)化難以成功，無法將綠色熒光蛋白基因在真菌中順利表達(dá)。

因此，建立一種快速的能夠在宿主和病原體之間產(chǎn)生類似綠色熒光蛋白高對(duì)比度而不需要遺傳轉(zhuǎn)化的染色方法對(duì)于觀察病原真菌的入侵過程很有意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種真菌熒光染色的方法及應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種真菌熒光染色的方法，該方法包括：

寄主植物表面病原真菌孢子入侵寄主葉組織前的染色：直接將染色液均勻噴霧在寄主植物葉片表面，使寄主植物葉片表面形成一層染色液膜，以觀察病原真菌孢子的萌發(fā)和入侵情況；

病原真菌菌絲侵入寄主葉組織后情況的染色：將病原真菌菌絲侵蝕的葉片浸入沸水浴的脫色液中，直至葉片中的葉綠素完全脫除，此時(shí)葉片為蒼白色；取出葉片，先用50%體積濃度的乙醇清洗2-3次使脫水的葉細(xì)胞恢復(fù)原狀，每次10-15分鐘，然后用50mM氫氧化鈉清洗2-3次使葉片變得透明，每次10-15分鐘，接著用純水清洗2-3次，每次10-15分鐘，最后將葉片浸入染色液中染色5-8min，以觀察病原真菌侵入到寄主葉組織后的情況。

其中，上述脫色液是95%（v/v）乙醇；

上述染色液是將2mg直接黃96（Direct?Yellow?96）溶于100mL?0.1M?的pH值為8.5的Tris–HCl緩沖液中配制而成。

本文中提及的將葉片侵入脫色液/染色液時(shí)，脫色液/染色液以蓋住葉片為宜。

本發(fā)明同時(shí)還提供上述方法在觀察真菌孢子在寄主植物表面的萌發(fā)和侵入過程中的應(yīng)用。

本發(fā)明相與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.安全環(huán)保：所用試劑均無毒無害，如95%和50%體積濃度的乙醇、50mM的NaOH都是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的常規(guī)試劑，比起常規(guī)脫色方法中用到的氯仿、苯酚、三氯乙酸、吡啶等試劑而言更加安全環(huán)保；

2.操作方法簡(jiǎn)單易行：在不影響染色效果的前提下，不僅省略了切片的過程，染色的步驟也大為簡(jiǎn)化。

附圖說明

圖1是葉片表面晚疫病菌孢子的萌發(fā)和入侵觀察圖（放大倍數(shù)10×40）。

其中：A-接種后0h；B-接種后12h；C-接種后24h。

圖2是晚疫病菌菌絲入侵后在葉組織內(nèi)的生長(zhǎng)情況觀察圖（放大倍數(shù)10×20）。

其中：A-接種后48h；B-接種后72h；C-接種后96h。

圖3是豇豆煤霉病菌入侵豇豆的觀察圖。

其中：A-豇豆煤霉病菌分生孢子入侵葉組織前于葉片表面；B-入侵后。

圖4是茄子炭疽病菌入侵茄子的觀察圖。

其中：A-茄子炭疽病菌分生孢子入侵葉組織前于葉片表面；B-入侵后。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中用到的染色液和脫色液：

染色液是將2mg直接黃96（Direct?Yellow?96）溶于100mL?0.1M?的Tris–HCl緩沖液（pH=8.5）中配制而成。

脫色液是95%（v/v）乙醇。

實(shí)施例1

以馬鈴薯晚疫病入侵過程為例。

1.材料

馬鈴薯品種和晚疫病菌生理小種：供試馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它，馬鈴薯晚疫病菌來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)。