[發(fā)明專利]藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2及其編碼的蛋白及應用

有效

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• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104911198B
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發(fā)明（設計）人: 陳文榮;邵俊怡;葉美娟;余柯達;吳潔慧;鄭曉梅
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/50;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 青島致嘉知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)37236
• 代理人: 劉曉

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及藍莓耐鹽、抗旱LON2蛋白酶基因VcLON2及其編碼的蛋白及應用。

背景技術

干旱和土壤鹽漬化等非生物逆境是當今限制作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素，植物的生產(chǎn)量大大關系著人們的生活。干旱發(fā)生頻率較高、范圍較廣，全球多數(shù)國家均遭受干旱的影響，干旱已經(jīng)成為全球最嚴重的自然災害之一，每年干旱造成經(jīng)濟損失達數(shù)千億美元。而土壤鹽漬化方面，全世界約有10億公頃的土地存在不同程度的鹽漬化，占世界陸地總面積的約10%，而我國就有近一億公頃鹽漬化土地。因此，提高作物的耐鹽和抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代作物育種工作急需解決的關鍵問題之一。

利用轉基因技術將具有優(yōu)良性狀的基因轉入植物中，以此開發(fā)高效的轉基因新品種具有廣闊的應用前景。一些研究已表明將植物本身及其他植物中耐鹽抗旱相關基因轉入植物中，可以提高轉基因植物的耐鹽抗旱能力。

LON蛋白酶是細胞器中蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的最主要成分，其可以通過降解損傷或者錯誤折疊的蛋白來控制蛋白的命運，在多種生理過程中都有著重要的作用。然而，目前大多數(shù)研究主要集中在古生菌、原核生物和動物等非植物體中，在植物體內(nèi)的研究相對較少。尤其該基因在植物抗逆（生物脅迫或非生物脅迫）中的功能研究尚無相關報道，因此，對于植物中LON蛋白酶的研究具有重要的研究價值和前景。特別是幾乎沒有關于藍莓VcLON2在抗逆等功能方面的研究。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明提出一種提高植物耐鹽、抗旱性的藍莓LON2蛋白酶基因VcLON2，所述VcLON2基因cDNA 核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明提出一種藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2的克隆方法，提取藍莓RNA，將其反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以下述序列為引物，通過RT-PCR獲得VcLON2基因序列，引物序列為：

VcLON2-F：5’-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’ ；

VcLON2-R：5’-TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’ 。

本發(fā)明還提出一種藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明提出一種權利要求1所述的藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。

進一步的，所述植物是煙草、玉米、水稻、小麥和藍莓。

本發(fā)明還提出一種植物超表達載體，其含有藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2。

進一步的，所述植物超表達載體為pSH737-CaMV35S-VcLON2。

此外，本發(fā)明還提出一種提高耐鹽性和抗旱性的方法，利用pSH737-CaMV35S-VcLON2借助于基因工程手段介導植物遺傳轉化，獲得的轉基因植物。

本發(fā)明的有益效果：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術，利用電子克隆及RT-PCR 技術，分離與鑒定藍莓耐鹽、抗旱相關基因序列信息，并通過根癌農(nóng)桿菌介導法將基因轉入本氏煙，經(jīng)過耐鹽、抗旱表型鑒定證明轉入VcLON2基因的植株耐鹽力和抗旱力明顯提高。

附圖說明

圖1為 VcLON2基因全長cDNA序列的擴增結果；

圖2 為實時熒光定量PCR法（qRT-PCR）分析鹽脅迫和干旱脅迫下VcLON2的表達情況；

圖3 -a為大腸桿菌pMD19-T-VcLON2 PCR檢測電泳結果；

圖3-b為pSH737質(zhì)粒和目的基因酶切圖；

圖4為 VcLON2轉基因本氏煙植株的PCR 鑒定；

圖5為 轉基因本氏煙及野生型在鹽脅迫和干旱脅迫處理30 d后的生長情況；

圖6為轉基因本氏煙及野生型在鹽脅迫和干旱脅迫處理30d后的株高、根長、鮮重和干重。

具體實施方式

實施實例1、VcLON2基因的獲得

1.1 RNA的提取