[發明專利]一種體外培養睪丸組織誘導生成精子細胞的方法

有效

• 申請號: 201510347492.6
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN104974982B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 李向東;姚建飛
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明涉及細胞工程領域，具體提供一種體外培養睪丸組織誘導生成精子細胞的方法，包括如下步驟：(1)培養膠塊的制備：將1.2％的瓊脂糖膠切塊置于6孔板中，加入培養基浸泡過夜后，吸掉舊培養基，加入新鮮培養基，此時的瓊脂糖膠塊用作培養膠塊；所述培養基的成分及含量為：90％MEMα+10％KSR；(2)取新生5.5天和新生10.5?12.5天的小鼠睪丸，去外層白膜，分割成塊狀組織樣品；(3)將組織樣品置于前述的培養膠塊上，將6孔板置于細胞培養箱中進行培養；(4)新生5.5天的小鼠睪丸組織培養22?25天得到圓形精子；新生10.5?12.5天的小鼠睪丸組織培養27天左右得到長形精子。

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，具體地說，涉及一種體外培養睪丸組織誘導生成精子細胞的方法。

背景技術

睪丸的功能主要是由不斷增殖的精原干細胞來維持，精原干細胞位于曲精細管生精上皮基膜上，一方面它能自我增殖形成更多的精原干細胞，另一方面，它可以經過幾次有絲分裂之后進入減數分裂，形成精母細胞，最終形成精子細胞。精原干細胞更新可產生2個精原干細胞或者是分裂產生2個通過胞質橋相連的成對所謂Apr型精原細胞，Apr進一步分裂形成4、8、16個細胞的Aal型(the Aaligned spermatogonia)精原細胞。Aal成為第一代分化的A1型精原細胞。A1型隨后進行連續六次的細胞分裂依次產生A2、A3、A4等中間型和B型精原細胞，B型最后一次分裂產生初級精母細胞，初級精母細胞減數分裂形成單倍體精子。體外精原干細胞增殖可通過培養基中添加膠質細胞系獲得的神經營養因子實現，且精原干細胞系可通過自我更新的方式體外培養2年，但體外精子生成目前還沒有突破。

從精原干細胞到精子的過程在老鼠和人中分別為35和64天(Sato,T.,et al.,Invitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem celllines.Nat Commun,2011.2:p.472.)。這個過程不是生殖細胞自發的，而是需要由周圍的體細胞產生的微環境，特別是支持細胞和間質細胞的互作。為模擬體內的精子生成環境，一個世紀以前就開始嘗試用器官培養的方法進行體外精子生成的研究，但是精子生成只能進行到減數分裂粗線期階段。

2011年Takuya Sato用gas–liquid interphase的方法，培養基中用敲除的血清取代物(KSR)取代胎牛血清(FBS)，用2.5天和3.5天的新生睪丸組織進行培養，可得到可育的精子。但是睪丸組織樣品的壞死情況依然較嚴重，同時得到單倍體的效率依然不高。這可能與體外培養體系營養的不充足和微環境的變化有關(Sato,T.,et al.,In vitroproduction of functional sperm in cultured neonatal mouse testes,2011)

精子生成是一個復雜的過程，有報道稱成體睪丸組織培養中的圓形精子在培養幾天后就消失，只有精母細胞可維持3到4周。目前用1.5-3.5天睪丸組織培養得到單倍體的概率較低，且沒有看到關于出生后10.5-14.5天(已啟動減數分裂無圓形精子)睪丸組織培養得到長形精子的報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種體外培養睪丸組織誘導生成精子細胞的方法。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明首先提供一種體外培養睪丸組織誘導生成精子細胞的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)培養膠塊的制備：將1.2％的瓊脂糖膠切塊置于6孔板中，加入培養基浸泡過夜后，吸掉舊培養基，加入新鮮培養基，此時的瓊脂糖膠塊用作培養膠塊；

所述培養基的成分及含量為：90％MEMα(invitrogen貨號：11120-022)+10％KSR(invitrogen貨號：10828)；