[發明專利]Myf6啟動子驅動肌肉組織MyoD基因的表達應用

在審

• 申請號: 201510347481.8
• 申請日: 2015-06-22
• 公開（公告）號: CN105039340A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 蔣思文;馬娟娟;彭健;柴進;李鳳娥
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/12
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及Myf6啟動子驅動肌肉組織MyoD基因的表達應用。

背景技術

啟動子是基因表達調控的重要順式元件,也是基因工程表達載體的一個重要組成部分。RNA聚合酶和轉錄因子可以識別并結合啟動子上特定DNA序列，從而起始轉錄(Landolinetal2010)。隨著基因工程的發展，常常需要構建一種能高水平表達異源蛋白質的表達載體。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是基因工程表達載體的重要元件(李珊珊等，2005)。

轉基因技術始于20世紀70年代,是科研人員按照需要將外源目的基因導入宿主細胞中,使外源基因穩定地整合在宿主基因組中，隨著宿主基因組的復制而擴增，得到穩定的遺傳和表達。原核顯微注射法是將在體外構建的目的基因在顯微操作儀下用極細的微吸管直接注射到處于原核時期的受精卵的原核中，當受體受精卵在進行DNA合成或修復時，把外源基因整合到基因組中。科學家曾成功地將小鼠的啟動子與大鼠的生長激素基因用原核顯微注射的方法構建了轉基因“超級鼠”，顯示了轉基因動物技術人為改造物種或生物性狀的可能性(Palmiteretal,1982)。有研究表明，外源基因在轉基因小鼠中可以穩定的傳至第七代(Wangetal,2009)。

中國是豬肉生產和消費大國，豬肉的消費約占肉類消費的64％，因此，優良豬品種的培育對養殖業的發展具有重要意義。常規育種技術曾在豬的品種改良方面發揮了巨大作用，但是存在選擇周期長、遺傳進展較慢等不足。現代動物分子育種中，利用分子標記技術可以對動物后代進行快捷可靠地篩選(魏景亮等2014)。但是，其改良的程度依然受限于品種自身已有的基因。利用轉基因技術可直接對受體動物的基因組進行遺傳修飾，從而創造出新性狀或新品種。因此，轉基因技術與常規育種相結合，是今后優質豬種培育發展的方向。

本發明是基于華中農業大學申請的公開號為103421781A，名稱為(豬肌肉組織特異性表達基因myf6啟動子及應用)基礎上的后續研究。本發明通過構建真核表達載體pSV40-Myf6-MyoDEGFP-N1并將其進行線性化處理，所述的線性化載體片段包括:豬肌肉組織特異性基因Myf6的啟動子、豬肌肉組織特異性基因MyoD、標簽基因EGFP、SV40polyA序列、SV40增強子序列。真核表達載體pSV40-Myf6-MyoDEGFP-N1的構建流程如圖1，線性化片段的序列見附錄，線性化的外源基因利用原核顯微注射技術制備轉基因小鼠。

到目前為止，關于豬肌肉組織特異性基因Myf6的啟動子(本文簡稱為Myf6啟動子)，驅動豬的肌肉組織特異性基因MyoD的表達在模式動物小鼠中的研究并未發表過。所以申請人在轉基因鼠活體水平上驗證豬肌肉組織特異性基因Myf6的啟動子是否可以驅使豬的肌肉組織特異性基因MyoD的上調表達，從而影響肌纖維的生長狀況。期望通過活體水平驗證豬的肌肉組織特異性基因Myf6的啟動子活性，為日后生產中制備轉基因豬提供功能性啟動子，從而為提高豬的瘦肉率提供技術基礎。

發明內容

本發明的目的在于利用Myf6啟動子驅動肌肉組織MyoD基因的表達應用。本發明通過制備轉基因小鼠，對來源于豬肌肉組織特異性基因Myf6的啟動子是否可以驅動豬的肌肉組織特異性基因MyoD的上調表達在活體水平上進行了相關生物學驗證，旨在獲得具有活性的豬肌肉組織特異性啟動子，為以后制備轉基因豬，提高豬的瘦肉率提供技術基礎。

申請人通過在轉基因小鼠活體水平上驗證豬肌肉組織特異性基因Myf6的啟動子活性，獲得的結果表明Myf6啟動子雖然沒有驅使轉基因鼠骨骼肌中MyoD基因的上調表達，但是通過對轉基因鼠不同組織表達譜的構建表明MyoD基因是在肌肉組織中特異性高表達，并且可以改變轉基因鼠的肌纖維的生長狀況，使肌束的面積和直徑都顯著高于野生型鼠，其單位面積內肌纖維數量顯著低于野生型鼠。本發明最終獲得功能性豬肌肉組織特異性啟動子Myf6，為日后生產中制備轉基因豬提供了功能性啟動子。

具體地，本發明通過以下技術方案實現：