[發(fā)明專(zhuān)利]一種枯草芽孢桿菌噴霧劑及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510346090.4
• 申請(qǐng)日: 2015-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104887715A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘆旭升;楊慧;馮媛;肖穎;于凱;陳竹;王巍;董志玲;呂雪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 哈高科白天鵝藥業(yè)集團(tuán)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K35/742
• 分類(lèi)號(hào): A61K35/742;A61K9/12;A61P17/02;A61K31/715;A61K31/717;A61K31/734
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

1.一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于它由枯草芽孢桿菌和基質(zhì)組成；所述枯草芽孢桿菌噴霧劑中枯草芽孢桿菌的含菌量為5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基質(zhì)是按質(zhì)量百分比由85～94％的營(yíng)養(yǎng)液、5～10％的甘油和1～5％的分散劑組成，所述的營(yíng)養(yǎng)液是由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及水混合而成，其中，營(yíng)養(yǎng)液中碳源的濃度為3～5mg/mL、營(yíng)養(yǎng)液中氮源濃度為10～13mg/mL、營(yíng)養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽濃度為0.05～0.1mg/mL；所述的碳源是由葡萄糖、蘆薈多糖和薄荷多糖按質(zhì)量比為1：(2～3)：(2～3)的比例組成；所述的氮源為大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉；所述的分散劑為萘磺酸鈉甲醛縮合物或吐溫-80。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽是由質(zhì)量百分含量為0.05％的氯化鈣水溶液、質(zhì)量百分含量為0.05％的氯化錳水溶液、質(zhì)量百分含量為0.1％的硫酸鎂水溶液和質(zhì)量百分含量為0.2％的磷酸氫二鈉水溶液按等比例混合而成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于所述的碳源是由葡萄糖、蘆薈多糖和薄荷多糖按質(zhì)量比為1：2：2的比例組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于所述的蘆薈多糖的提取是按以下步驟進(jìn)行：

一、蘆薈前處理：取新鮮庫(kù)拉索蘆薈葉洗凈去刺，橫切成5mm薄片架在培養(yǎng)皿上，用鼓風(fēng)干燥箱55℃的條件下烘干12h，然后將烘干的蘆薈葉放入粉碎機(jī)粉碎，得到蘆薈粉，置于棕色試劑瓶密封保存?zhèn)溆茫?/p>

二、按質(zhì)量體積比為1:30g/mL的比例將蘆薈干粉放入蒸餾水中，復(fù)水30min后用超聲波輔助進(jìn)行提取，然后8000r/min離心15min，取上清液，再放入旋轉(zhuǎn)發(fā)儀在0.085MPa，65℃的條件下濃縮至原體積的1/2～1/3，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇再置于4℃冰箱，靜置過(guò)夜，然后2500r/min離心10min，取沉淀，即完成。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于所述的薄荷多糖是按以下步驟制備的：

一、稱(chēng)取干燥的薄荷藥材，粉碎后過(guò)40目～60目篩，得到薄荷粉末；將薄荷粉末加入到蒸餾水中浸泡12h～20h，再加熱回流提取1h～2h，得到混合物A；向混合物A中加入纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值至5～6，再在溫度為40℃～55℃、pH值為5～6的條件下酶解0.5h～3h，得到纖維素酶水解后的混合物A；

步驟一中所述的纖維素酶的加入量與混合物A的質(zhì)量比為(0.3～1.5):100；

二、向纖維素酶水解后的混合物A中加入蛋白酶和菠蘿蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至7～7.5，再在溫度為55℃～60℃下酶解0.5h～3h，得到提取液；

步驟二中所述的蛋白酶的加入量與纖維素酶水解后的混合物A的質(zhì)量比為(0.3～0.8):100；步驟二中所述的菠蘿蛋白酶的加入量與纖維素酶水解后的混合物A的質(zhì)量比為(0.3～0.6):100；

三、使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在溫度為62℃～68℃下將提取液的體積減壓濃縮至原體積的1/2～1/3，得到濃縮液；向濃縮液中加入無(wú)水乙醇，再在室溫下靜置8h～16h，再進(jìn)行抽濾，得到沉淀物質(zhì)；依次使用無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚和丙酮洗滌對(duì)沉淀物質(zhì)分別清洗3次～5次，再在零下15℃～30℃，冷凍干燥5h～10h，得到薄荷多糖；

步驟三中所述的濃縮液的體積與無(wú)水乙醇的體積比為1:(4～6)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌是按照以下步驟進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)的：

一、取枯草芽孢桿菌接種于LB固體斜面培養(yǎng)基上，在37℃條件下，培養(yǎng)18～20h；

二、取步驟一培養(yǎng)至第2～3代的枯草芽孢桿菌的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下培養(yǎng)12～14h；

三、取步驟二培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌液接種至含有質(zhì)量百分含量為0.009～0.08％的氯化鈣和質(zhì)量百分含量為0.01～0.07％的氯化錳的LB液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH為7.2～7.4、通氣比例為1:1的條件下培養(yǎng)20h，然后將培養(yǎng)溫度降至15℃～20℃繼續(xù)培養(yǎng)60h，即完成所述的枯草芽孢桿菌的優(yōu)化。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種枯草芽孢桿菌噴霧劑，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌為BS224菌株。