[發明專利]一種Aβ1-42寡聚體及其制備、鑒定方法

在審

• 申請號: 201510345031.5
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN104974243A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 岳峰;陸春玲
• 申請（專利權）人: 廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;G01N33/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 梁山丹

技術領域

本發明涉及β-淀粉樣蛋白領域，具體涉及一種Aβ1-42寡聚體及其制備、鑒定方法。

背景技術

阿爾茨海默病(Alzheimer’S?disease，AD)也稱為老年癡呆癥，是發生在老年期或老年前期的一種慢性、持續性、退化性的腦變性疾病，其臨床表現為記憶減退、認知障礙、人格改變等。該病的病理特征主要包括大腦皮質和海馬區域的細胞外出現以β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid,Aβ)為核心的老年斑、細胞內神經原纖維纏結等病變。在美國AD是僅次于心血管病、癌癥和腦卒中的第四大死亡殺手，據統計目前全世界AD發病人數高達2500萬，我國AD患者已達到600余萬，居世界首位，AD病程時間長且目前尚無徹底根治的藥物，它嚴重威脅著人類的健康，給患者及家屬帶來巨大的影響。因此建立理想及可靠的AD動物模型，對于研究和探討AD的病因、病理過程以及尋找和篩選有效藥物顯得尤為重要。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白經β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產生的含有39～43個氨基酸的多肽，Aβ的大量沉積，是導致AD病人腦內老年斑周邊神經元變性和死亡的主要原因。Aβ在腦內有多種存在形式，如：低分子量Aβ單體、Aβ寡聚體、不溶性Aβ纖維體等。Aβ單體是可溶性的低分子物質，但是當胞內環境，如pH、溫度、離子濃度、蛋白濃度等改變時會誘發Aβ單體快速聚集，形成二聚體、三聚體或可溶性的Aβ寡聚體，Aβ寡聚體的穩定性較差，易向Aβ纖維體轉化。Aβ的種類分為Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42和Aβ1-43，其中Aβ1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研究Aβ1-42是當前的熱點。

近年來，有科學家提出，Aβ纖維體與記憶損害及神經細胞缺乏的關系不大，推測可溶性Aβ單體和Aβ寡聚體是AD的主要致病因素。國內外制備、合成Aβ1-42的寡聚體均不穩定，淀粉樣肽在體外容易隨機形成各種高分子量或低分子量的混合產物，這種組分不均一的混合物直接影響到實驗結果的準確性和可靠性。近年來，許多研究者用多種方法制備Aβ1-42寡聚體，但收率都較低、產物不穩定、成分復雜。Aβ1-42寡聚體的產物不穩定，成分復雜，就無法保障其誘導模型的成功建立，從而直接影響到實驗結果的準確性和可靠性。因此，制備成分較單一、穩定的Aβ1-42寡聚體，可為AD動物模型的成功建立打下良好的基礎，也為AD的發病機制、病理過程、尋找和篩選有效藥物提供有效依據。

發明內容

針對現有制備、合成Aβ1-42的寡聚體不穩定、成分復雜、收率低等不足，本發明提供一種新合成的Aβ1-42寡聚體。本發明提供的Aβ1-42寡聚體成分較單一、產物穩定，為建立理想和可靠的AD模型提供良好的基礎；其制備方法簡單、收率高、省時；所采用的SDS-PAGE結合蛋白免疫印記鑒定方法，具有敏度高、特異性強、方便快速、操作簡單、費用較低等優點。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種Aβ1-42寡聚體，所述的Aβ1-42寡聚體主要為寡聚體和單體的混合物；所述寡聚體經蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為12-20KD，為三聚體和四聚體；所述單體經蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為4-4.5KD。

以上所述Aβ1-42寡聚體，所述的Aβ1-42寡聚體的制備方法為：取Aβ1-42合成肽，在室溫下完全溶解在HFIP中，所得溶液轉移到離心管中，用干浴氮吹儀使HFIP徹底吹干；加入DMSO使離心管底部的固體完全溶解，加入HEPES緩沖液，混合均勻，即得。

以上所述Aβ1-42寡聚體的制備方法，包括以下步驟：

1.將1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL?HFIP中，在室溫下靜置30-60分鐘，得到完全溶解的溶液；

2.將步驟1得到的溶液轉移到硅化的離心管，在干浴氮吹儀上吹8-15分鐘，使HFIP徹底吹干，得到透明片狀固體沉于管底；

3.在所述離心管中加入40μl?DMSO，使離心管底部的固體完全溶解，再加入pH值為7.4的濃度為l0mM?HEPES緩沖溶液，使溶液最后終體積為1ml，混合均勻，即得。

以上所述Aβ1-42寡聚體的鑒定方法，包括以下步驟：

1.SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳：取Aβ1-42寡聚體溶液2μL，與18μL?4X電泳上樣緩沖液混合均勻，然后上樣，電泳上樣量為5ul/泳道，電泳用的膠為4–12％的梯度膠，同時在一個泳道加入10μL分子量為3.6-260KD的預染分子量標準品，電泳時選擇80V電壓電泳30-40分鐘,然后轉100v電壓繼續電泳2小時；