[發(fā)明專利]EV713C蛋白酶作用靶點檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510342092.6
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN105067574B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李冰清;孟紅;秦立增;李鵬;李志會;岳盈盈;宋楠楠
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;山東中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 濟南魯科專利代理有限公司37214
• 代理人: 曹玉琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種EV71 3C蛋白酶作用靶點檢測試劑盒，及檢測方法。

背景技術(shù)

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是手足口病的主要致病原之一。臨床上多表現(xiàn)為輕微癥狀：發(fā)熱、手足口部的皰疹、皰疹性咽峽炎。而嚴(yán)重者則引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥如無菌性腦膜腦炎、脊髓炎、神經(jīng)源性的肺水腫等。嚴(yán)重者有生命危險。臨床上治療EV71感染主要是對癥治療，目前尚無特異抗病毒藥物，尋找和發(fā)現(xiàn)抗EV71病毒藥物是目前面臨的中藥課題。

尋找抗EV71藥物目前主要有2大途徑：1：在已知病毒蛋白功能域的基礎(chǔ)上進(jìn)行針對性設(shè)計；2：在中草藥、海洋生物、陸地微生物等自然界中萃取、尋找。后者往往是新結(jié)構(gòu)、新機制抗病毒藥物的重要來源，對于抗病毒藥物的研究具有重要意義，但是，這些自然資源中獲得的化合物的抗病毒作用靶點卻常常存在難度。因此，尋找靶點并開發(fā)一套合適的檢測方法是急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明以3C蛋白為抗病毒作用靶點，開發(fā)了一套檢測試劑盒及檢測方法，其目的是檢測待檢測化合物是否可抑制3C蛋白，進(jìn)而判斷其是否可抑制EV71病毒，是否可以作為抗EV71病毒的藥物進(jìn)行研究應(yīng)用。

3C蛋白是手足口病病原EV71的蛋白酶，其酶活性直接影響病毒復(fù)制效率和致病毒力(Weng K.F.，Li M.L.，Hung C.T.et al.Enterovirus 7 l 3C protease cleaves a novel target CstF-64 and ihibits cellular polyadenylation[J].PLOS Pathog，2009，5(9)：elO00593.)。本研究以該蛋白酶測活方法為基礎(chǔ)，建立了3C蛋白酶活性的成套試劑，用于檢測藥物靶點。如果藥物可以抑制3C蛋白酶的活性，則提示該藥物的作用靶點是EV71的3C蛋白酶的酶活中心(His41,Glu71和Cys147催化三聯(lián)體)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種EV71 3C蛋白酶作用靶點檢測試劑盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反應(yīng)緩沖液，所述3C蛋白的序列如下(如SEQ ID NO.1所示)：

GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ。

所述多肽底物為Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，N端連接Dabcyl基團，C端連接Edans基團。

所述酶解反應(yīng)緩沖液為反應(yīng)buffer液，其包括如下組分：25mM Tris-HCl(pH 8.0),200mM NaCl。

一種EV71 3C蛋白酶作用靶點檢測方法，如下：將待檢測化合物、3C蛋白加入到酶解反應(yīng)緩沖液中，然后加入多肽底物，混勻，反應(yīng)30min后，在336nm波長激發(fā)下，檢測其在490nm處的熒光強度；若檢測不到熒光，則表明該待檢測化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71病毒能力，可作為抗EV71病毒的藥物進(jìn)行進(jìn)一步的研究應(yīng)用；若能夠檢測到熒光，則表明該待檢測化合物不能抑制3C蛋白。

進(jìn)一步地，檢測方法如下：多肽底物在336nm波長激發(fā)下，獲得其在490nm處的熒光強度值A(chǔ)(表示未降解時的熒光強度)。將3C蛋白多肽底物加入到反應(yīng)buffer液后，混勻反應(yīng)30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波長激發(fā)下，獲得其在490nm處的熒光強度值B(經(jīng)降解后的熒光強度)。在上述反應(yīng)體系中加入一定濃度的待檢測化合物，并重復(fù)以上步驟操作，獲得化合物存在時的熒光強度C，通過比較A,B,C三值大小，確定化合物對3C蛋白酶的酶活性的影響(C的數(shù)值在A、B之間，C的數(shù)值越小，說明待檢測化合物對3C蛋白酶的酶活性的抑制越明顯，C的數(shù)值越大，說明待檢測化合物對3C蛋白酶的酶活性的抑制越弱)。