[發明專利]檢測三唑磷的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201510341109.6
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN105044325A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 馮才偉;羅曉琴;吳鵬;何方洋;馮靜;楊爍;宋茹;王然
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測三唑磷的酶聯免疫試劑盒，可定性、定量檢測蔬菜中三唑磷藥物的殘留量。

背景技術

三唑磷，又名三唑硫磷，英文通用名Triazophos，化學名稱O,O-二乙基-O-(1-苯基-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯。純品為淺棕黃色液體，20℃時在水中的溶解度為30～40mg/L，可溶于大多數有機溶劑；對光穩定，在酸、堿介質中水解，140℃分解。三唑磷具有強烈的觸殺和胃毒作用，殺蟲效果好，殺卵作用明顯，滲透性較強，無內吸作用，是一種中等毒、廣譜有機磷殺蟲劑、殺螨劑，兼有一定的殺線蟲作用，已在我國水稻、棉花、蔬菜和蘋果等作物上登記，主要用于防治糧食、棉花、果樹、蔬菜等主要農作物上的許多重要害蟲。由于三唑磷的應用效果好，相對甲胺磷等高毒農藥其毒性低，因此，在農作物上應用較廣泛。

然而，三唑磷的大量使用也給一些食用農產品及環境帶來了殘留問題。三唑磷屬有機磷農藥，中等毒性，對神經、肝、腎、心、肺及生殖系統等多臟器均有明顯的毒副作用，其中毒主要機理是抑制膽堿酯酶的活性。歐盟規定三唑磷最大殘留限量(maximumresiduelimit，MRL)為不得檢出的農藥品種；日本“肯定列表制度”中規定，除了小麥、大麥、黑麥、玉米、蕎麥、其他糧谷、棉籽和棉籽油設定了最大殘留限量，其余適用“一律標準”，即0.01mg/kg；我國國家標準《GB2763-2005食品中農藥最大殘留限量》中限定三唑磷的MRL為稻谷0.05mg/kg，棉籽0.1mg/kg，沒有制定蔬菜中三唑磷的最大殘留限量標準。因此，建立三唑磷殘留的快速檢測技術，加強監測、科學使用三唑磷，對于保障人類健康與食品安全，降低環境污染，減少對農副產品出口產生的影響等具有重要意義。

我國標準體系中提供的測定蔬菜中三唑磷的方法均是多殘留檢測方法，有國家標準(GB/T19648-2006、GB/T5009.218-2008、GB/T20769-2008、GB/T23204-2008、GB/T23205-2008、GB/T23376-2009)、行業標準(NY/T1379-2007、NY/T761-2008、SN/T1950-2007、SN/T0148-2011)和地方標準(DB34/T1076-2009)，涉及到的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法和色譜-質譜聯用法。儀器方法具有靈敏度高、結果準確等優點，但是資金和人員等投入成本較高。本發明應用酶聯免疫法，測定蔬菜中三唑磷藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠檢測蔬菜中三唑磷藥物殘留量的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、三唑磷標準品溶液、酶標二抗、三唑磷特異性抗體、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為三唑磷偶聯抗原，所述酶標二抗為酶標記的羊抗鼠抗抗體。

所述三唑磷偶聯抗原是由三唑磷半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述三唑磷半抗原是由三唑磷和乙酰氯反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述三唑磷特異性抗體是以三唑磷偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述三唑磷特異性抗體可為三唑磷單克隆抗體或三唑磷多克隆抗體，其中優選三唑磷單克隆抗體。

所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標二抗是采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括三唑磷標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述三唑磷標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸或液鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。