[發明專利]溫度敏感型載體pBBR1MCS?2?Ts2及其應用

有效

• 申請號: 201510340512.7
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN104894154B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 江賢章;黃建忠;劉洪嬌;周芬;張明亮;祁峰;陶勇
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,任鳳華

技術領域

本發明涉及生物技術領域中溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts2及其應用。

背景技術

把一段有用的目的DNA片段通過DNA重組技術，送進受體細胞中去進行復制和表達的工具叫載體(Vector)。質粒是重組DNA技術中常用的載體，質粒存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子。一個理想的載體大致應有下列一些特性：(1)分子量小、多拷貝、松弛控制型；(2)具有多種常用的限制性內切酶的單切點；(3)能插入較大的外源DNA片段；(4)具有遺傳標記，便于鑒定和篩選；(5)對宿主細胞無害。

寬宿主質粒pBBR1MCS-2是應用性很廣的載體，該質粒由pBBR1質粒改造而來。pBBR1質粒來源于革蘭氏陰性菌Bordetella bronchiseptica S87(Antoine R and Locht C.Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms.Mol Microbiol.1992,6(13):1785-1799)。pBBR1MCS-2含有一個卡那霉素(kan)抗性篩選標記，它的大小僅有5145bp，這些特性使得該質粒適用于DNA克隆、蛋白表達，廣泛用于革蘭氏陰性菌的分子操作。

溫度敏感型質粒載體可以方便的控制質粒在宿主中的存在。當溫度比較低時，質粒可以存在宿主中，而當溫度提高后，溫度敏感型質粒載體將丟失或整合到染色體上。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何構建溫度敏感型載體。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了構建重組載體的方法。

本發明所提供的構建重組載體的方法，為構建重組載體的方法1，是將SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載體，將該重組載體命名為pBBR1MCS-2-Ts2；

所述目的基因表達盒編碼的蛋白質為將SEQ ID No.2所示的蛋白質進行A2)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質，即所述目的基因表達盒編碼的蛋白質為SEQ ID No.6所示的蛋白質；所述A2)為將SEQ ID No.2第130位的His突變為Gln。

上述方法1中，所述目的基因表達盒中的目的基因為將SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進行B2)的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子；所述B2)為將SEQ ID No.1第2183位的C突變為G。

其中，SEQ ID No.1由5145個核苷酸組成，SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸為rep的編碼基因，編碼SEQ ID No.2所示的rep蛋白。

上述方法1中，所述目的基因表達盒的序列可為SEQ ID No.5。

其中，SEQ ID No.5的第238-900位編碼SEQ ID No.6所示的蛋白質。

上述方法1中，所述目的基因表達盒中啟動所述目的基因表達的啟動子為將SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子進行如下C2)、C3)和C4)這三種中至少一種的改造、保持SEQ ID No.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子：

C2)如下C21)和/或C22)：

C21)將SEQ ID No.1第1732位的A突變為G；

C22)將SEQ ID No.1第1780位的G突變為T；

C3)如下C31)和/或C32)：

C31)將SEQ ID No.1第1747位的C突變為T；

C32)將SEQ ID No.1第1776位的T突變為A；

C4)將SEQ ID No.1第1751位的T突變為A；