[發明專利]一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法

在審

• 申請號: 201510339945.0
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN104977383A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 郭狄
• 申請（專利權）人: 中山鼎晟生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/12
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

技術領域

本發明屬于食品檢測領域，具體涉及一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法。

背景技術

目前主要的食用藻類主要有螺旋藻及小球藻。螺旋藻類含有豐富的營養成分，包括多種維生素(?B1、B2、B6、B12、C、E、K?等)、礦物質(?鈣、鐵、鋅、磷、鎂和碘等)、氨基酸、β-胡蘿卜素、γ?-亞油酸、葉綠素及蛋白質。世界衛生組織(?WHO)定為“?人類?21世紀的最佳保健品”?,?1981?年美國食品和藥品管理局(?FDA)?確認其為“最佳蛋白質來源之一”,?我國衛生部也批準其為“?新資源食品”。?，目前，國內外對螺旋藻進行過系統的安全性毒理學評價,?確認它是安全有效健康的食品。?隨著人民生活水平及保健意識的提高,?人們對保健食品的需求越來越大,?同時對保健食品安全性也提出了更高的要求。而螺旋藻在人工養殖和自然環境中，?都可能被有毒藍藻污染，伴生一類可對人類肝臟發生損害的微囊藻毒素。微囊藻毒素是一種單環?7?肽，?至?21?世紀初已確定的?MCYSTs?的同分異構體已達?60?多種，是在藍藻水華污染中出現頻率最高、?產毒量最大的一類藻類毒素，?其具有強烈的促癌作用，其作用的靶器官是肝臟，?它能強烈地抑制蛋白磷酸酶的活性，?導致細胞內多種蛋白質的過磷酸化，?導致肝細胞的損傷。由于其生態毒理學效應，?日益引起人們的關注。近年來，由于全球環境污染加重，通過產毒微囊藻和其它有害藍藻污染的水體暴露微囊藻毒素是人類面臨的一個公共衛生問題。一些國家和WHO?還推薦了飲用水和娛樂用水中微囊藻毒素的安全限量標準，因此，如何有效檢測混在螺旋藻中的微囊藻毒素的含量對于我國對藻類保健品的質量監管至關重要。

目前，微囊藻毒素的檢測方法包括蛋白磷酸酶抑制分析PPIA法、?ELISA?法及?HPLC?法，PPIA法、?ELISA?法在檢測過程中易受干擾，HPLC?法檢測過程中樣品前處理復雜。為此，本發明提供一種檢測靈敏度高，定量準確的超高效液相色譜-串接質譜檢測方法。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術中存在的上述問題，提供一種檢測靈敏度高、抗干擾性強及檢測結果準確的螺旋藻類食品中微囊毒素的檢測方法。

本發明的技術方案如下：

一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法,包括以下步驟：

（1）樣品前處理：取螺旋藻固體樣品1-5g，置于碾缽中研碎后加提取溶劑，放入磁力攪拌器中攪碎，離心，沉淀后用GF/C濾紙過濾，再次加入提取液，重復提取3-5次，將提取液置于旋轉蒸發儀上加溫濃縮，得樣品待測液備用；

（2）制備陽性對照液：取微囊毒素RR?和微囊毒素LR?標準品1-5g，加超純水溶解配制成1.0ug/ml的陽性對照溶液備用；

（3）樣品凈化：將步驟（1）中制備的樣品待測液加入HLB柱中進行富集，洗脫，收集洗脫液置于燒瓶中，于旋轉蒸發儀上蒸干，再次富集，再次洗脫，并將洗脫液于旋轉蒸發儀上蒸干，取蒸干后的樣品加入3-5倍體積的甲醇，轉入離心管中，加5-10ml純化水溶解，離心，取上清液待測；

（4）HPLC測定樣品中微囊毒素的含量：將步驟（2）中配制好的1.0ug/ml的陽性對照溶液分別進行一級全掃描與二級全掃描機多反應檢測，優化色譜條件與質譜條件，對步驟（3）中的待測上清液進行HPLC-串接質譜法測定。

優選的，步驟（1）中所述的螺旋藻固體樣品劑型包括膠囊、片劑及精粉。

優選的，步驟（1）中所述的提取溶劑的加入量為30-50ml。

優選的，步驟（1）中所述的提取溶劑選自冰醋酸或醇溶液中的一種或多種。

優選的，步驟（1）中所述的冰醋酸為體積濃度為5-10%的冰醋酸。

優選的，步驟（1）中所述的醇溶液為丁醇、甲醇和水的混合溶液，所述的丁醇、甲醇、水的體積比為（1-3）：（4-12）：（20-50）。

優選的，步驟（1）與步驟（3）中所述的離心速度為10000-12000r/min，離心時間為20-30min；步驟（1）中所述的加溫溫度為50-80℃。

優選的，步驟（3）中所述的洗脫過程具體為：先用20-30%的甲醇水溶液洗脫，再用90-100%的甲醇水溶液洗脫。

優選的，步驟（3）中再次洗脫過程具體為：先用濃度為10-20%的甲醇水溶液洗脫，再用60-70%的甲醇水溶液洗脫。