[發明專利]Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應用的實驗方法

在審

• 申請號: 201510337521.0
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN104922700A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發明（設計）人: 盧中秋
• 申請（專利權）人: 盧中秋;趙光舉
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;G01N33/50;A61P39/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應用的實驗方法，其特征在于，所述的Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應用的實驗方法包括體外實驗和體內試驗；

所述的體外實驗包括：

步驟一、小鼠AEC-II的分離純化；

步驟二、小鼠肺泡II型上皮細胞的鑒定；

步驟三、RT-PCR檢測PQ暴露小鼠AEC-II中Sirt1、Nrf2基因表達改變與PQ作用的時間、劑量效應關系；

步驟四、Western-bolt法檢測PQ暴露小鼠AEC-II中Sirt1、Nrf2蛋白表達改變與PQ作用的時間、劑量效應關系；

步驟五、免疫沉淀法檢測PQ暴露小鼠AEC-IINrf2的乙酰化水平；

步驟六、化學比色法檢測SOD、CAT、GSH、MDA；

步驟七、ELISA檢測HO-1表達；

步驟八、CO-IP法檢測Sirt1與Nrf2蛋白之間的相互作用；

所述的體內實驗包括：

步驟一、小鼠原代MSC提取與培養；

步驟二、BMSC的免疫熒光鑒定；

步驟三、慢病毒轉染BMSC細胞；

步驟四、PQ中毒小鼠實驗分組及模型建立；

步驟五、PRC法、Western-blot法檢測Nrf2、Sirt1蛋白的表達情況；

步驟六、化學比色法檢測MDA、SOD、GSH、CAT改變；

步驟七、ELISA法檢測IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1蛋白含量；

步驟八、肺組織損傷的檢測。

2.如權利要求1所述的Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應用的實驗方法，其特征在于，所述的RT-PCR檢測PQ暴露小鼠AEC-II中Sirt1、Nrf2基因表達改變與PQ作用的時間、劑量效應關系中的PCR引物為：

Sirt1，上游序列為5’-acgctgtggcagattgttatta-3’，下游序列為5’-ttgaagaatggtcttgggtctt-3’；

Nrf2，上游序列為5’-attctttcagcagcatcctctc-3’，下游序列為5’-acacttccaggggcactatcta-3’；

β-actin，上游序列為5’-atatcgctgcgctggtcgtc-3’，下游序列為5’-aggatggcgtgagggagagc-3’。

3.如權利要求1所述的Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應用的實驗方法，其特征在于，所述的PQ中毒小鼠實驗分為8組：空白對照組、NS組、PQ組、PQ+NS組、PQ+LV-MSC-GFP組、PQ+LV-MSC-Nrf2組、PQ+LV-MSC-Sirt1組、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組；

每組小鼠的處理如下：

實驗前動物禁食8h，禁水4h；

PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組：經左側腹腔注射20％PQ溶液，染毒后1min內經尾靜脈注射濃度為10×10⁶/ml?LV-MSC-Nrf2細胞懸液和LV-MSC-Sir1細胞懸液各0.05ml；

PQ+LV-MSC-Nrf2組：經左側腹腔注射20％PQ溶液，染毒后1min內經尾靜脈注射濃度為5×10⁶/ml?LV-MSC-Nrf2細胞懸液0.1ml；

PQ+LV-MSC-Sirt1組：經左側腹腔注射20％PQ溶液，染毒后1min內經尾靜脈注射濃度為5×10⁶/ml?LV-MSC-Sirt1細胞懸液0.1ml；

PQ+LV-MSC-GFP組：經左側腹腔注射20％PQ溶液，染毒后1min內經尾靜脈注射濃度為5×10⁶ml?LV-MSC-GFP細胞懸液0.1ml；

PQ+生理鹽水組：經左側腹腔一次性注射20％PQ溶液，染毒后1min內經右側腹腔注射；

PQ組：經左側腹腔注射20％PQ溶液；

NS組：經左側腹腔注射等體積的生理鹽水；

空白對照組：未給予任何處理。