[發明專利]水蛭素抗凝血酶活性的測定方法

有效

• 申請號: 201510337079.1
• 申請日: 2015-06-17
• 公開（公告）號: CN104965017B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 楊劍;熊文朋;劉艷芳;修立輝
• 申請（專利權）人: 廣西師范學院
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 靳浩

1.一種水蛭素抗凝血酶活性的測定方法，其特征在于，將已知一定質量的含有未知活性的水蛭素與足量的凝血酶反應后，在交聯劑作用下進行交聯反應，終止交聯后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合體系，其中，所述交聯劑為BS³，所述第一混合體系經電泳后采用光密度掃描，在已知蛋白帶密度的對照物基礎上根據水蛭素-凝血酶化合物的蛋白帶密度得到水蛭素-凝血酶化合物的質量，根據水蛭素與凝血酶以質量比為1:5結合得到水蛭素-凝血酶化合物得出參與反應的有效凝血酶的質量，再根據凝血酶中有效凝血酶的質量分數以及水蛭素的質量計算得出該一定質量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即為水蛭素抗凝血酶的活性值。

2.如權利要求1所述的水蛭素抗凝血酶活性的測定方法，其特征在于，所述凝血酶中有效凝血酶的質量分數的測定方法如下：將足量的水蛭素與已知一定質量的凝血酶反應后，在交聯劑BS³作用下進行交聯反應，終止交聯后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第二混合體系，經電泳后采用光密度掃描，在已知蛋白帶密度的對照物基礎上根據第二混合體系中水蛭素-凝血酶化合物的蛋白帶密度得到水蛭素-凝血酶化合物的質量，進而得到有效凝血酶的質量，其與已知一定質量的凝血酶的質量比即為所述凝血酶中有效凝血酶的質量分數。

3.如權利要求2所述的水蛭素抗凝血酶活性的測定方法，其特征在于，將多組不同質量的含有未知活性的水蛭素與恒定量且足量的凝血酶反應后得到一一對應的多組第一混合體系，從而得出多組水蛭素抗凝血酶的活性值，求其均值，即得水蛭素抗凝血酶的活性。

4.一種水蛭素抗凝血酶活性的測定方法，其特征在于，將一系列梯度質量的含有未知活性的水蛭素與恒定量的凝血酶反應后，在交聯劑BS³作用下進行交聯反應，終止交聯后得到一一對應的含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第三混合體系，經電泳后根據未反應的水蛭素、未反應的凝血酶以及水蛭素-凝血酶化合物的蛋白帶的變化確定水蛭素抗凝血酶活性的范圍。

5.一種水蛭素抗凝血酶活性的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、向標記為1-8的管中依次添加結合緩沖液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8個管中分別加入2μL凝血酶溶液，混勻后，將其均置于37℃下水浴5min，所述結合緩沖液為質量分數為0.9％的氯化鈉溶液；所述水蛭素溶液的濃度為0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以質量分數為0.9％氯化鈉溶液為溶劑配制的凝血酶蛋白濃度為4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；

步驟二、向8個管中分別加入1.5μL交聯劑BS³溶液，于室溫下交聯反應30min，所述交聯劑BS³溶液由12.5mmol BS³和20mmol磷酸鈉溶解于1.5μL 0.9％的氯化鈉溶液得到的溶液；

步驟三、向8個管中分別加入1μL終止緩沖溶液，反應15min以終止交聯反應，所述終止緩沖溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL 0.9％的氯化鈉溶液中，并用鹽酸調節其pH為7.5；

步驟四、向8個管中分別加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后每管取10μL進行SDS-PAGE分析，得出標記為6-8的管中樣品經SDS-PAGE分析得出的水蛭素-凝血酶化合物的蛋白帶的密度未發生變化，因此得出水蛭素抗凝血酶的活性范圍在標記為5的管與標記為6的管之間，即抑制3NIH凝血酶需要的水蛭素的質量為0.5-0.6μg，即水蛭素抗凝血酶的活性為5000-6000ATU/mg。