[發(fā)明專利]一種提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510334881.5
• 申請(qǐng)日: 2015-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104894143B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 開(kāi)國(guó)銀;李磊磊;郝小龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/82;A01H5/06;A01H6/50
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采用基因克隆方法獲得丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因，分析其編碼框序列，將丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因插入植物表達(dá)載體，分別構(gòu)建SmWRKY70基因的過(guò)表達(dá)載體；所述的丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)采用基因克隆方法獲得丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子序列，所述丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)根據(jù)丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因序列，設(shè)計(jì)QRT-PCR引物，對(duì)丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行組織表達(dá)譜分析和誘導(dǎo)響應(yīng)分析；

(4)根據(jù)丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子基因序列，構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)丹參SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；

(5)將步驟(1)所獲得的SmWRKY70基因的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化丹參的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；

(6)將步驟(5)所獲得的含SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子的植物過(guò)表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根；所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根是指：在驅(qū)動(dòng)插入基因SmWRKY70表達(dá)的組成型啟動(dòng)子CaMV35S的內(nèi)部及插入基因SmWRKY70的內(nèi)部，分別設(shè)計(jì)上游及下游特異性引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根株系；

(7)QRT-PCR分析步驟(6)獲得的經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中SmWRKY70基因的表達(dá)，篩選出過(guò)表達(dá)SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表達(dá)量提高的株系；QRT-PCT分析轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中SmWRKY70基因以及丹參酮生物合成途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)，具體方法為：對(duì)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根克隆進(jìn)行總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別設(shè)計(jì)檢測(cè)基因及看家基因Actin的引物，進(jìn)行QRT-PCR擴(kuò)增，分析SmWRKY70基因以及丹參酮生物合成途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)情況；

(8)用高效液相色譜法測(cè)定步驟(7)獲得的過(guò)表達(dá)SmWRKY70基因株系中丹參酮的含量，篩選丹參酮含量提高的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根株系；對(duì)SmWRKY70基因的表達(dá)量顯著提高的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中丹參酮的含量進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定的具體測(cè)定方法如下：將丹參酮粗提物各取20μL，注入高效液相色譜儀，色譜條件為：色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為乙腈：水＝65：35，柱溫為30℃，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，其特征在于，步驟(1)所述的植物表達(dá)載體為經(jīng)過(guò)改造獲得的pCAMBIA2300⁺載體，包含CaMV35S啟動(dòng)子和終止子、多克隆位點(diǎn)、復(fù)制起始點(diǎn)及卡那霉素抗性位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1。