[發明專利]一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應器克隆生產工藝

有效

• 申請號: 201510326112.0
• 申請日: 2015-06-15
• 公開（公告）號: CN104855293B
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 林潘海
• 申請（專利權）人: 泉州正和堂生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應器克隆生產工藝，屬于生物工程技術領域。

背景技術

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kmuraet Migo）是我國傳統名貴中藥材，味甘，性微寒，具有生津養胃、滋陰清熱、潤肺益腎、明目強腰等功效。唐代開元年間的《道藏》把：“鐵皮石斛、天山雪蓮、三兩重的人參、百二十年的首烏、花甲之茯苓、蓯蓉、深山靈芝、海底珍珠、冬蟲夏草”并稱為中華九大仙草。根據國家藥典記載，其主要藥效成份為石斛多糖和石斛堿。

由于鐵皮石斛可觀的經濟效益，畝產收益可達10萬元以上，這也吸引了越來越多的種植戶投身于鐵皮石斛的種植行業中來，就具體種植面積而言，全國集約化種植(大棚內種植)面積已超10萬畝。而全國中藥材種植用地目前已經高達驚人的12000萬畝（占到全國糧食總種植面積的1/10）,這也導致了更多的糧食種植用地進一步被占用、糧食減產、糧食儲量得不到保障、糧食價格不穩定等關乎民生的危情出現。

另外由于鐵皮石斛種植周期長，一般需要三到四年時間才可以采收，一些不法商家以其他生長較快且藥效一般的石斛品種仿冒鐵皮石斛進行高價售賣，歁騙消費者，擾亂了市場。此外，在鐵皮石斛的種植過程中由于大量使用農藥、激素、化肥和未經凈化處理過的水源等，導致鐵皮石斛受到重金屬、農藥、激素等的污染，這不但影響了鐵皮石斛品質，也會隨患者食用鐵皮石斛后進入體內，導致各種慢性疾病的發生。

鐵皮石斛藥用原球莖是由鐵皮石斛果莢中的種胚微粒經液體克隆形成球莖原胚體，該階段，可通過營養調節和特殊的培養條誘導使原球莖富集了大量的初生和次生代謝產物，其中石斛堿、毛蘭素和多糖的含量均為其整個生長過程中最高的階段。

鐵皮石斛原球莖已被證實與原藥材鐵皮楓斗和鮮條等具有同等的藥用價值，衛計委也擬將鐵皮石斛原球莖列入新食品原料目錄中。然而，由于原球莖生長的特殊性，如球莖個體大，是單一細胞團的1600倍；對通氣量、光照強度和對溫度敏感；對培養基的營養成份要求較高；生長周期長等。上述因素極大地限制了鐵皮石斛原球莖的大規模工廠化生產，影響了鐵皮石斛產業的快速發展。本發明基于上述問題的不斷研究和探素，成功開發出應用于原球莖工廠化生產的大型生物反應器和生產工藝。

本發明的實際應用可以有效地解決上述問題，應用150升植物細胞生物反應的克隆生產工藝，可實現年產量達1000公斤/罐的藥用原球莖，這相當于傳統種植10畝地的年平均產量，且單批次生產周期僅為兩個月，是傳統種植的1/12。本發明專利的生產過程是隔離式無菌培養，所收獲的原球莖均無激素殘留、農藥殘留、重金屬污染、有害元素污染。與傳統原球球莖組培相比，本發明具有生產規模大，生產成本低，石斛藥效成份表達穩定、表達量高，克隆生產全程可控，產品安全系數高。

發明內容

本發明的任務是在于提供一種鐵皮石斛藥用原球莖大型生物反應器克隆生產工藝，旨在保證原球莖藥用價值的同時實現大規模工廠化生產，包括以下步驟。

1）選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于十月至十一月期間，先用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4℃下處理3天后，取出用手術刀片將果莢的多余部份切除，只留1～2cm長的果柄，稱重并記錄。果莢先用酒精棉球擦拭表面，于5~10%次氯酸鈉處理10~20min，無菌水沖洗3~5次，然后浸入70~75%酒精中30s~1min，無菌水沖洗3~5次，置于接種盤中切開果莢底部，均勻地播入裝有種子液體培養基的通氣培養瓶中。

其中種子液體培養基的配方為1/2改良MS、4%蔗糖、15%馬鈴薯提取汁、pH5.5，其中1/2改良MS的配方為：銷酸銨和氯化鈣減半，其他不變。培養條件為光照2600Lux，溫度25℃，通氣1m3/min，培養45天后即可準備接入大型生物反應器。

2）種胚微粒誘導萌發，得到原球莖種子，配制克隆生產培養基和補料培養基，轉入150升植物細胞反應器中，在位滅菌后將原球莖種子接入，接種量為：15g/L，先后進行暗培養和光照培養，完成培養收集原球莖后進行稱重換算增殖系數。

其中，原球莖克隆生產培養基的配方為：改良MS、2%蔗糖、1%葡萄糖、15%馬鈴薯提取汁、NAA 1mg/L，補料本方為：克隆培養基濃縮10倍；接種量為：15g/L；暗培養的參數為：溫度25℃、通氣2m3/min、轉速120轉/min、pH5.5、周期15天；光照培養的參數為溫度27℃、通氣4m3/min、轉速150轉/min、pH5.5、周期25天，每隔7天進行一次補料。