[發(fā)明專利]一種CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測(cè)方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510324303.3
• 申請(qǐng)日: 2015-06-15
• 公開（公告）號(hào): CN104946759A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙薇薇;胡昌明;燕啟江;郭周萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

1.一種CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測(cè)方法，其特征在于，首先提取血液基因組DNA，將其稀釋后通過PCR擴(kuò)增CYP2C19*17所在序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后將對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行SNaPshotPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后通過毛細(xì)管電泳法檢測(cè)熒光信號(hào)并通過軟件分析SNP位點(diǎn)，通過不同的熒光檢測(cè)結(jié)果確定檢測(cè)?SNP?位點(diǎn)處堿基變化確定基因型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下步驟：

1）DNA提取：提取方法參照TIANampBloodDNAkit(購自Tiagen，貨號(hào)DP318)的說明書，提取完畢的DNA計(jì)算其濃度并稀釋至100μg/mL；

2）PCR擴(kuò)增CYP2C19*17所在序列：PCR反應(yīng)體系中組分及體積份數(shù)分別為Q5^?Master?Mix12.5份，雙蒸水8.5份，ward1份，Reverse1份；準(zhǔn)確量取PCR反應(yīng)體系23μL，向其中加入2μL稀釋后DNA模板；置PCR管放于PCR儀上并將反應(yīng)程序設(shè)置如下：1：98℃，3?min；2：98℃，10?sec；3：58℃，30?sec；4：72℃，1?min；5：往復(fù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)?；6：72℃，5?min；7：25℃?；

3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化：取2體積份的ExoSAP-IT和3體積份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分裝到新的8連管中，每管加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，混勻微離心，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：1：37℃,15?min?；2：80℃,15?min?3：4℃；

4）SNaPshotPCR擴(kuò)增：SNaPshotPCR反應(yīng)體系中組分及體積份數(shù)分別為SnaPshot?ReadyMix?2.5份；5×sequencing?buffer?1份；Primers?Mixer???2份；ddH2O?3.5份；其中引物為SNE_CYP2C19*17；準(zhǔn)確量取SNaPshotPCR反應(yīng)體系9μL，向其中加入1μL步驟3）得到純化產(chǎn)物，混勻微離，按以下程序進(jìn)行PCR1：96℃，10?sec；2：55℃，5?sec；3：60℃，30?sec；4：往復(fù)進(jìn)行25?個(gè)循環(huán)；5：4℃?；

5）SNaPshotPCR產(chǎn)物純化：向SNaPshotPCR產(chǎn)物中加入1μLSAP酶，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：1：37℃，60?min?；2：75℃，15?min?；3：4℃；

6）SNaPshot分析：步驟5）獲得的產(chǎn)物經(jīng)?ABI?3100-XL基因分析儀毛細(xì)管電泳法檢測(cè)熒光信號(hào)，通過GENEMAPPERIDV4.1軟件分析確定SNP位點(diǎn)，通過不同的熒光檢測(cè)結(jié)果確定檢測(cè)?SNP?位點(diǎn)處堿基變化確定基因型。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法的檢測(cè)位點(diǎn)為?CYP2C19*17:?c.-806C>T(SNP:rs12248560)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR中擴(kuò)增CYP2C19*17的引物對(duì)如下：正向引物：GCCCTTAGCACCAAATTCTC；反向引物為：ATTTAACCCCCTAAAAAAACACG。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測(cè)方法，其特征在于，SNaPshot中擴(kuò)增CYP2C19*17的引物如下：TTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG。

6.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法在CYP2C19代謝相關(guān)藥物治療中的應(yīng)用。