[發明專利]FasL蛋白作為生物標記在定性檢測大腸癌干細胞對阿司匹林敏感性中的應用

在審

• 申請號: 201510323724.4
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN104950112A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 黃建;陳志剛;孔冬
• 申請（專利權）人: 浙江大學;孔冬
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈自軍

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及人FasL蛋白作為生物標記在定性檢測大腸癌干細胞對阿司匹林敏感性中的應用。

背景技術

Aspirin(阿司匹林)，化學名乙酰水楊酸，是20世紀初德國化學家Felix?Hoffman合成的一個結構簡單的小分子化合物。阿司匹林是世界上使用最多，使用時間最長(至今已有100多年的使用歷史)，且不會產生藥物依賴性的非甾體抗炎藥。流行病學和臨床試驗表明，Aspirin除了用于解熱、抗血小板凝聚等，還可防治包括結大腸癌(CRC)、食道癌、肺癌在內的多種腫瘤。其中，對大腸癌的腫瘤抑制作用尤為突出，是Lancet、New?England?Journal?of?Medcine、JAMA等權威雜志持續關注的熱點。

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，據美國癌癥協會2014年報告(CA)，美國大腸癌新發病例數及死亡病例數均居全部惡性腫瘤的第3位；在我國大腸癌發病率與死亡率亦呈明顯上升趨勢，且呈現出年輕化趨勢。盡管我國大腸癌基礎研究與早期干預有較大進步，但發病率與死亡率仍呈明顯上升趨勢。大約50～60％大腸癌患者出現肝轉移，其5年存活率可超過40％。

研究證明大腸癌等惡性腫瘤中存在腫瘤干細胞(Cancer?Stem?Cell；CSC)，CSC是一群具有很強的自我更新能力和多向分化潛能的細胞，雖在腫瘤細胞中所占比例很小，但在放化療后出現明顯富集并產生治療抗性，是大腸癌治療和控制復發轉移的難點所在。Aspirin雖然對大腸癌具有較強的腫瘤抑制作用，但是Aspirin對不同的惡性腫瘤或同種腫瘤的不同類型的個體治療效果存在差異性。目前Aspirin用于大腸癌臨床輔助治療面臨的主要難題是缺乏指導個體化用藥的參考指標，對病人的用藥缺乏針對性，其療效也很難預測。此外，隨著Aspirin臨床應用的不斷增加，其耐藥性及其副作用的出現是限制其臨床應用的重要原因，如何在清除腫瘤干細胞的同時盡量減少其副作用也是Aspirin臨床應用中要解決的問題。

發明內容

本發明通過檢測大腸癌的普通腫瘤細胞(以下簡稱AC細胞)和大腸癌干細胞(以下簡稱TC細胞)對Aspirin的敏感性發現Aspirin選擇性清除TC細胞，在此基礎上進一步檢測TC細胞中凋亡相關基因的變化，發現Aspirin選擇性上調TC細胞中FasL基因的表達水平，說明FasL蛋白是Aspirin的應答蛋白。

本發明還發現TC細胞對Aspirin的敏感性與TC細胞中FasL蛋白的表達水平呈正相關，即阻斷FasL蛋白與Fas結合后，Aspirin對TC細胞的生長抑制作用消失，TC細胞凋亡減少；對TC中FasL蛋白進行封閉實驗，進一步驗證了阿司匹林誘導的FasL蛋白表達水平的上調為直腸癌干細胞對阿司匹林的敏感性所必須。

基于以上發現，本發明提供了FasL蛋白作為生物標記在定性檢測大腸癌干細胞對阿司匹林敏感性中的應用，所述Fasl蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明所述定性檢測是指檢測大腸癌干細胞是否對阿司匹林敏感，一般情況下，如Aspirin處理后，大腸癌干細胞中FasL蛋白的表達量是使用前的兩倍，則認定該直腸癌干細胞對Aspirin敏感。

本發明還提供了能夠與權利要求1所述FasL蛋白特異性結合的抗體在制備定性檢測大腸癌干細胞對阿司匹林敏感性的試劑中的應用。

所述的抗體可以是完整的抗體分子、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、重鏈和輕鏈的同二聚體和異二聚體，以及抗原結合片段和衍生物。完整的抗體分子可以是多抗或單抗，優選為單抗。

所述定性檢測可以采用流式細胞分析，采用該方法使用的抗體需攜帶熒光標記，熒光標記如PE等。

蛋白表達包括轉錄和翻譯兩個過程，蛋白表達水平的提高，轉錄的mRNA含量也必然提高，基于此，本發明又提供了編碼權利要求1所述FasL蛋白的mRNA作為生物標記在定性檢測大腸癌干細胞對阿司匹林敏感性中的應用。

本發明還提供了能夠與所述mRNA特異性結合的探針或引物在制備定性檢測大腸癌干細胞對阿司匹林敏感性中的應用。

所采用的方法一般為定量PCR。

所述引物可以是擴增整個mRNA的引物，也可以是擴增mRNA特征區域的引物，所述探針是識別mRNA特定區域的核苷酸，一般攜帶標識。

根據實施例的記載，本發明提供了一對具體擴增所述mRNA的引物，如下所示：

上游引物：5’-GCAGCAGCCCTTCAATTACCCAT-3’