[發(fā)明專利]UBQ10和GAPDH作為水稻條紋病毒侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510323270.0
• 申請日: 2015-06-09
• 公開（公告）號: CN104975085A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周彤;周益軍;方鵬;杜琳琳;蘭瑩;孫楓;劉之洋
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明運用geNorm和NormFinder軟件鑒定了感水稻條紋病毒(Rice?strip?virus，RSV)植株中熒光定量PCR的內(nèi)參基因組合，UBQ?10和GAPDH作為RSV侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因，明顯優(yōu)于單個內(nèi)參基因的校正效果，可應(yīng)用于RSV侵染植株基因功能研究，屬于分子生物學領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水稻條紋葉枯病，病原為水稻條紋病毒，是一種由介體昆蟲灰飛虱以持久性經(jīng)卵方式傳毒。水稻感染RSV后引起死苗，減產(chǎn)嚴重，除水稻外，還危害小麥等作物。20世紀60、90年代后期該病害在華北、華東等地暴發(fā)成災(zāi)，近年來，感病品種的廣泛種植及稻麥輪作方式的推廣和冬季氣候變暖等環(huán)境條件的變化使傳毒介體灰飛虱的發(fā)生量不斷上升，導致該病害在華東稻區(qū)大面積發(fā)生。迄今為止，幾乎沒有能有效防治病毒病的化學藥劑，治蟲防病的應(yīng)急措施無法作為一項長期策略，而研究寄主在病毒侵染后基因的功能進而病害防控中加以利用則是一種更為環(huán)保的手段。要獲得準確和可靠的基因表達結(jié)果首先需要有用于數(shù)據(jù)校正的內(nèi)參基因，也有利于不同研究間數(shù)據(jù)的借鑒與比較。用于校正和標準化的內(nèi)參基因必需在任何條件下是持續(xù)且穩(wěn)定的表達，否則就會導致錯誤的結(jié)果，現(xiàn)有的研究多以TIP41-Like等單個基因作為內(nèi)參基因，其在不同處理時可能會有穩(wěn)定性問題，有必要盡快確立一種合適的內(nèi)參基因體系以解決這一問題。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明針對上述研究背景，以接種水稻條紋病毒的日本晴水稻為材料對常用的內(nèi)參基因進行分析，發(fā)現(xiàn)UBQ?10和GAPDH是表達最穩(wěn)定的基因，以這兩個基因作為RSV侵染后水稻中基因功能分析的內(nèi)參基因組合，明顯優(yōu)于單個內(nèi)參基因的校正效果。

本發(fā)明所提供的水稻條紋病毒侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因組合，是通過以下方法獲得的：

1)用熒光定量PCR的方法，對接種水稻條紋病毒的日本晴水稻以14對水稻中常用內(nèi)參基因的表達及其相關(guān)引物的特異性進行評估；

2)運用geNorm程序評估候選內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性；

3)通過NormFinder軟件驗證geNorm程序的運算結(jié)果；

4)依據(jù)geNorm程序可以計算引入一個新內(nèi)參基因后標準化因子的配對差異V值，其默認閾值為0.15。根據(jù)Vn/n+1比值可以判斷引入一個新內(nèi)參基因是否會對標準化因子產(chǎn)生顯著影響，如果Vn/n+1大于0.15，則需要再引入第n+1個內(nèi)參基因；如果Vn/n+1小于0.15，則不必再引入新的內(nèi)參基因；

5)RSV侵染條件下熒光定量PCR多內(nèi)參和單內(nèi)參校正的數(shù)據(jù)分析比較，驗證多內(nèi)參基因的組合是否優(yōu)于單內(nèi)參基因。

在RSV侵染的條件下鑒定的用于校正熒光定量PCR最合適的內(nèi)參基因UBQ?10和GAPDH的應(yīng)用范圍包括：RSV侵染植物中病毒的定量；RSV侵染植株中相關(guān)基因的表達分析以及RSV侵染植株模式的研究。

本發(fā)明能為在RSV侵染植株中獲得準確和可靠的基因表達結(jié)果提供理論依據(jù)，其結(jié)果可以用于研究RSV侵染植株基因功能。

附圖說明：

圖1熒光定量PCR擴增的特異性分析。(A)候選內(nèi)參基因的溶解曲線圖，實驗有三次生物學重復，溶解曲線呈單峰；(B)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測候選內(nèi)參基因擴增的特性條帶；(C)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量；

圖2候選內(nèi)參基因的表達水平分析。(A)14個候選內(nèi)參基因的平均Ct值；(B)比較RSV侵染植株與對照(不侵染)植株中14個候選內(nèi)參基因的表達水平，注：Ct?values：Ct值；

圖3RSV侵染條件下熒光定量PCR內(nèi)參基因的geNorm分析，注：Average?expression?stability?values(M)：內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性平均值(M)，pairwise?variation(V)：配對差異值(V)；

圖4RSV侵染條件下熒光定量PCR內(nèi)參基因的NormFinder分析，注：Average?expression?stability?values(M)：內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性平均值(M)；

圖5RSV侵染條件下OsPR1b和OsWRKY基因表達在多內(nèi)參或單內(nèi)參條件下的數(shù)據(jù)分析比較，注：Relative?expression?levels：相對表達水平。

具體實施方式：

下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

實施例1，RSV侵染植株中基因功能分析內(nèi)參基因組合的獲得