[發明專利]重組正電荷多肽干擾素及在抗腫瘤和抗病毒治療中的應用

有效

• 申請號: 201510320365.7
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN104987381B
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 王紅;印紅梅;郭睿;陳耐飛;崔久嵬;胡繼繁
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C07K14/57;C07K19/00;C12N15/867;C12N5/10;C12N15/31;C12N15/23;A61K38/21;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/12
• 代理公司: 長春市四環專利事務所(普通合伙) 22103
• 代理人: 張冉昕

本發明公開了重組正電荷多肽干擾素及在抗腫瘤和抗病毒治療中的應用，本發明通過cDNA文庫的方式，將多肽片段與抗性蛋白同一閱讀框內克隆至載體質粒，通過抗生素篩選之后，獲得同一開放閱讀框內的ATG?多肽?卡拉霉素融合蛋白文庫，將此文庫酶切克隆至真核表達系統并與干擾素3’端連接成干擾素?多肽文庫質粒，將此文庫質粒包裝成病毒后感染預先穩轉帶有報告基因的腫瘤細胞，通過流式細胞儀分選出報告熒光最強的腫瘤細胞，提取DNA鑒定該細胞中的多肽序列，篩選出可能增強干擾素效果的多肽片段，并采用熒光素酶實驗和MTT實驗對其抗腫瘤效果進行驗證，證實重組正電荷多肽干擾素能增強抗腫瘤效果。

技術領域

本發明采用cDNA文庫方法，篩選出能增強干擾素抗腫瘤作用的多肽片段，重組正電荷多肽干擾素在抗腫瘤和抗病毒治療中的應用。

背景技術

干擾素是1957年英國科學家Isaacs和Lindenmann在研究病毒干擾現象時發現的，是一種由病毒感染誘導產生的、具有抗病毒作用的細胞因子，能夠抑制病毒復制，是一類高活性的糖蛋白。近年來研究發現干擾素除抗病毒活性外，還具有廣泛調節功能，如調節和控制細胞復制、增生及機體免疫系統功能，在惡性腫瘤、免疫疾病、血管增生性疾病和纖維化疾病等病理狀態中發揮作用。但干擾素在人體含量極低，又無適當的制造方式，因而限制了其臨床應用的價值。直到最近，生物技術突飛猛進，干擾素才得以量產而廣泛的應用于臨床。主要通過抑制腫瘤細胞增生、促進腫瘤細胞凋亡、抑制癌基因表達、調節免疫、抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤轉移、與其他抗癌藥物協同、誘導腫瘤腫瘤細胞分化等機制抗腫瘤。干擾素目前主要分為三大類﹕IFN-α，IFN-β和IFN-γ，由于IFN-α和IFN-β在理化特性、抗原性及受體等方面均有許多相似之處，并發揮相似的生物學效應，故以往IFN-α和IFN-β被合稱為Ⅰ型干擾素，而IFN-γ則歸為Ⅱ型干擾素。

cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA(cDNA)與適當的載體(常用噬菌體或質粒載體)連接后轉化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細胞的cDNA文庫。cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中，在特定發育階段表達的蛋白質的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性。cDNA文庫比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有內含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA。真核生物基因組DNA十分龐大，其復雜程度是蛋白質和mRNA的100倍左右，同時含有大量的重復序列。采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。因此從染色體DNA為出發材料直接克隆目的基因相對于從mRNA出發的cDNA克隆比較困難。高等生物通常約具有10⁵種不同的基因，但在一定時間階段的單個細胞或個體中，都僅有15％左右的基因得以表達，產生約15000種不同的mRNA分子。可見，由mRNA出發的cDNA克隆，其復雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。cDNA文庫在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優勢，從而使它在個體發育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。

綜上所述，干擾素作為一種已成熟應用于臨床的抗腫瘤藥物，具有廣譜抗腫瘤，調節免疫，抑制腫瘤血管形成等作用，然而，臨床實踐證明現有干擾素僅對部分實體腫瘤和白血病治療敏感，與一線抗腫瘤藥物相比療效有限，更多的時候被用作輔助抗腫瘤和免疫調節藥物，其臨床應用仍不夠廣泛。為提高干擾素抗腫瘤的效果，我們通過cDNA文庫篩選的方式，將干擾素與多肽片段融合，形成重組多肽-干擾素，通過體外實驗篩選出比單純干擾素更有效抑制腫瘤生長的干擾素-多肽組合。

發明內容