[發明專利]一種伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201510319783.4
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN104878111A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 楊翠;奚志勇;朱儉;羅永平
• 申請（專利權）人: 奚志勇
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術：

沃爾巴克氏體(Wolbachia)是廣泛分布于節肢動物體內的共生微生物，它可能是昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩定地存在于宿主的生殖細胞內，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質不親和、雌性化和殺雄性等調控宿主的生殖活動。通過這些調控作用促進其在宿主種群內廣泛傳播。

在沃爾巴克氏體(Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質不親和(Cytoplasmic?Incompatibility，CI)是最常見的一種類型。它表現為當被沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精子和卵子結合后胚胎無法發育。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胞質不親和的特性可導致Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替代。它的應用對蚊媒病防治具有巨大的價值。近期研究發現，沃爾巴克氏體(Wolbachia)不僅具有上述的特性外，同時它還能在蚊子體內與蚊子攜帶的一些重要的病原生物(如登革病毒，瘧原蟲等)相互作用，抑制它們在蚊子體內的增值和擴散從而在阻斷這些病原生物傳播于人類。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內組織的分布相關，所以，了解沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子體內組織分布有助于快速篩選出傳播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監測沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時也有利于高效率地監測大規模大地域范圍的沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。

在自然界中，蚊子的種類有很多，常見的有伊蚊和庫蚊兩種。伊蚊分為白紋伊蚊和埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不攜帶沃爾巴克氏體。由于沃爾巴克氏菌只能存活于宿主體內，不能在體外自由生活，因而如何有效特異地檢測沃爾巴克氏菌是對該細菌研究的必備工具。比較常用的檢測手段有聚合酶鏈反應法(PCR法)和免疫染色法。免疫染色法耗時耗力，而且特異性不好。隨著PCR方法的普及，針對沃爾巴克氏體的檢測有了很大的進步。不同蚊種攜帶不同的沃爾巴克氏體，通過PCR結果能夠直觀的看出蚊子攜帶的不同沃爾巴克氏體類型，這樣為我們的日常檢測提供了很大的便利。由于伊蚊攜帶的B型沃爾巴克氏體和庫蚊攜帶的wpip型沃爾巴克氏體基因序列相似度達到99.7％，因此區別這兩種類型的沃爾巴克氏體需要特異性很好的引物。

發明內容：

本發明的目的是提供一種專一性強、特異性高和靈敏度高的伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測引物。

本發明的伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測引物，其特征在于，包括：

wAlbBF：5’-ACGTTGGTGGTGCAACATTTG-3’(其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示)；

wAlbBR：5’-TAACGAGCACCAGCATAAAGC-3’(其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示)。

本發明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測方法，其特征在于，提取樣品DNA，以該樣品DNA為模板，以上述伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測引物wAlbBF和wAlbBR作為PCR引物，進行PCR擴增，擴增反應完成后，判斷是否擴增到擴增產物來判斷樣品中是否含有伊蚊B型沃爾巴克氏體。

所述的進行PCR擴增，其反應條件優選為：94℃預變性5分鐘；95℃變性5秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，30個循環；72℃最后延伸5分鐘。

本發明的第三個目的是提供一種伊蚊B型沃爾巴克氏體的檢測試劑盒，包括檢測引物和PCR試劑，其特征在于，所述的檢測引物為：

wAlbBF：5’-ACGTTGGTGGTGCAACATTTG-3’；

wAlbBR：5’-TAACGAGCACCAGCATAAAGC-3’。

利用本發明的檢測引物按照本發明的檢測方法能夠快速高效專一的檢測出伊蚊B型沃爾巴克氏體，具有專一性強，特異性高(只檢測出伊蚊B型沃爾巴克氏體，而庫蚊沃爾巴克氏體和伊蚊A型沃爾巴克氏體不發生擴增)，靈敏度高，其最低檢測限為1010×10^-5ng/μl。