[發明專利]一株假交替單胞菌突變菌株及其應用

有效

• 申請號: 201510317461.6
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN104894024B
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 何海倫;武翠玲;楊興昊;劉丹;張姜;吳日幫;黃雅雯
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/06;C12N9/52;C12R1/01
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一株假交替單胞菌突變菌株Pseudoalteromonas sp.CSN423-M及其應用。

背景技術

蛋白酶是世界三大工業用酶之一，占世界酶類銷售總額的60％，在食品、醫藥、制革、洗滌劑、廢物處理等領域都有很好的應用前景，且廣泛分布于植物、動物和微生物中，微生物源蛋白酶較動植物源蛋白酶有顯著優勢，如來源廣、生產周期短、產量高、高產菌株易于選育、下游處理技術相對簡單，易于實現工業化生產等，因此，微生物源蛋白酶成為研究的熱點。目前芽孢桿菌是工業化生產蛋白酶的主要菌種。

海洋微生物源蛋白酶具有獨特的酶學性質，日益引起人們的關注，如海洋微生物產生的蛋白酶在高鹽濃度條件下仍具有較高的催化活力，可滿足那些高鹽條件下酶催化反應受抑制的工業化生產要求。深海嗜壓微生物是嗜壓酶重要來源，高壓增加了酶活性和熱穩定性，且使酶具有良好的立體專一性。利用海洋微生物開發的酶制劑，最適催化溫度接近自然環境，不僅降低了生產過程中的能耗，而且使工藝流程簡單化，在工業上有著良好的應用前景。

然而從自然界分離到的菌株產酶活力一般都很低，要實現高產、低耗和優質的高效轉化，則需進行定向或非定向性菌種改良，以期突破或解除微生物代謝調控，獲得蛋白酶高產菌株以滿足工業化生產需求，這將具有十分顯著的經濟效益和深遠的社會效益。

發明內容

本發明的目的在于提供一株高產胞外蛋白酶的假交替單胞菌突變菌株及其應用。

一株假交替單胞菌突變菌株，分類命名為Pseudoalteromonas sp.CSN423-M，該菌于2015年1月9日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址：中國湖北省武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC No.M 2015024。

所述假交替單胞菌突變菌株(Pseudoalteromonas sp.CSN423-M)由分離自渤海海域的菌株假交替單胞菌Pseudoalteromonas sp.CSN423經紫外誘變選育。

假交替單胞菌突變菌株CSN423-M經菌落形態鑒定：該菌在平板上培養24h后的菌落呈白色，圓形，表面光滑不透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，無鞭毛，無莢膜。

假交替單胞菌突變菌株CSN423-M經生理生化測定，氧化酶試驗為陽性，脲酶試驗為陰性，接觸酶試驗為陽性，卵磷脂酶實驗為陽性；能水解明膠、淀粉、纖維素；甲基紅試驗為陰性，V-P試驗為陰性，H₂S實驗為陽性，硝酸鹽還原測定為陽性、亞硝酸鹽還原測定陽性。生長溫度范圍4～30℃。

該菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

該菌株能夠產胞外蛋白酶，具有水解蛋白的功能，經測定，該菌培養96h后，蛋白酶活性達1461.33U/mL，可用于蛋白酶的工業化生產，對蛋白酶的研究和利用具有重要價值。

附圖說明

圖1.假交替單胞菌突變菌株CSN423-M的掃描電鏡照片(80000倍)；

圖2.假交替單胞菌突變菌株CSN423-M及部分相關菌株依據16S rDNA序列構建的系統發育樹；

圖3.平板透明圈法篩選蛋白酶高產菌株；

圖4.發酵培養的假交替單胞菌CSN423與突變菌株CSN423-M胞外蛋白酶酶譜活性電泳圖；

圖5.發酵培養不同時間的假交替單胞菌CSN423與突變菌株CSN423-M產胞外蛋白酶活性。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例進一步解釋本發明，但不對本發明構成任何限定。以下實施例中除特殊說明外，均為本領域常規試劑和方法步驟。

實施例1 通過紫外誘變的方法獲得假交替單胞菌突變菌株CSN423-M。

紫外誘變的出發菌株假交替單胞菌CSN423，分離自渤海海域。

S1.制備菌懸液

取已活化的假交替單胞菌CSN423接種于液體2216E培養基，15℃，200rpm,培養至對數期，8000rpm離心10min，收集菌體，用0.85％無菌生理鹽水離心洗滌2次后，制成菌懸液，用顯微鏡直接記數法，調整菌液濃度為1×10⁸CFU/mL。

S2.紫外誘變

采用波長253.4nm，功率為20w的紫外燈，照射距離40cm，在無菌工作臺進行誘變。

取2mL制備好的菌懸液，于直徑6cm的無菌培養皿中，置于磁力攪拌器上攪拌，開啟紫外燈，照射一定時間。