[發明專利]一種檢測水產制品中副溶血性弧菌的ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 201510314503.0
• 申請日: 2015-06-10
• 公開（公告）號: CN105158470A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發明（設計）人: 張紅星;張帥;齊穎穎;謝遠紅;劉慧;段慧霞
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 北京市合德專利事務所 11244
• 代理人: 王文會;劉榜美

技術領域

本發明屬于免疫學和生物檢測技術領域，具體還涉及食品安全相關的微生物檢測分析技術，尤其提供了一種檢測水產制品中副溶血性弧菌的ELISA試劑盒。

背景技術

副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus，Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于近海區域、鹽湖及魚、貝類等海產品中，是沿海地區引起食物中毒的重要病原菌，可導致患者出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應，嚴重者可引起敗血癥，危及生命。副溶血性弧菌引起的疾病已成為我國一個嚴重的食源性公共衛生問題之一，由該菌引發食品中毒案例居微生物食源性疾病暴發案例之首，且呈上升趨勢。

目前，副溶血性弧菌的檢測多采用傳統的方法，周期長，一般需要5至7天時間，過程繁瑣，無法適應大量的樣品篩查。特別是在水產制品中，樣品存放時間過長會導致樣品的變質，對檢測結果帶來不良影響。以抗體為基礎的免疫學檢測是近幾年發展較快的檢測方法。其中ELISA檢測方法因其快速、靈敏、準確、穩定及批量檢測的特點，成為食品安全檢測中不可或缺的重要技術手段。

ELISA試劑盒是運用免疫學原理進行食品安全檢測的重要產品，但由于微生物抗原的特殊性,對水產品中的副溶血性弧菌檢驗應用較為少見。目前我國的檢測產品大多都依賴于進口，價格昂貴，并且需要配備專門的檢測儀器。因此，研究和開發具有自主知識產權的用來檢測食源性微生物的ELISA試劑盒具有重要意義。該專利即為以水產制品中副溶血性弧菌為檢測對象的ELISA試劑盒。

發明內容

本發明的目的就是針對現有的檢測副溶血性弧菌技術的不足和缺陷，發明了適用于水產制品中副溶血性弧菌的定性、定量快速篩查的ELISA試劑盒。

本發明所述的試劑盒，包括固相載體、檢測抗體、洗滌液、稀釋液、顯色液（顯色液A、顯色液B）、樣品提取液和終止液。其中固相載體為96孔酶標板，且包被有特異性副溶血性弧菌的單克隆抗體一。該ELISA試劑盒中的檢測抗體即為用辣根過氧化物酶標記的特異性副溶血性弧菌的單克隆抗體二。

進一步，所述的ELISA試劑盒制備過程中所需的試劑有如下幾種：

1、PBS緩沖液：NaCl8g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O3.6g、KH₂PO₄0.24g，加蒸餾水至1000mL，調節溶液的pH值至7.4。

2、包被液（CB液）：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，NaN₃0.2g，加蒸餾水至1000mL。密封蓋好，4°C存放備用。

3、洗滌液(PBST含0.05％Tween20的PBS)：1LPBS中加入Tween-20500μL。

4、封閉液：100mLPBS中加入1gBSA，100μLTween-20。

5、抗體稀釋液：100mLPBST中加入0.1gBSA。

6、底物顯色液：

（1）底物顯色A液：醋酸鈉13.6g,檸檬酸1.6g,30%雙氧水0.3mL,蒸餾水加至500ml。

（2）底物顯色B液：乙二胺四乙酸二鈉0.2g,檸檬酸0.95g,甘油50mL,取0.15gTMB溶于3mLDMSO中,蒸餾水加至500ml。4℃避光保存。

7、終止液：2mol/LH₂SO₄溶液。

8、樣品提取液：滅菌的0.9%NaCl溶液和PBS緩沖液共250mL。

為了增加檢測的準確性，本發明試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。所述的陽性對照副溶血性弧菌陽性血清，所述的陰性對照為未免疫副溶血性弧菌的正常小鼠血清。

進一步，所述的ELISA試劑盒制備主要步驟如下：

1、單克隆抗體的制備及篩選；

2、酶標板包被抗體；

3、辣根過氧化物酶標記特異性副溶血性弧菌單克隆抗體；

4、配備所需試劑；

5、將所有試劑按如下規格組成試劑盒。