[發明專利]一種長春新堿的ELISA檢測方法有效
| 申請號： | 201510313265.1 | 申請日： | 2015-06-04 |
| 公開（公告）號： | CN104914101B | 公開（公告）日： | 2018-06-19 |
| 發明（設計）人： | 張曉娟;郭俊崗;沈鴻 | 申請（專利權）人： | 大同市城區北關社區衛生服務中心;大同市中西醫結合醫院;南京腦科醫院 |
| 主分類號： | G01N21/78 | 分類號： | G01N21/78;G01N33/68 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 037000 山*** | 國省代碼： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 長春新堿 包被抗原 抗體 制備 人工免疫原 病人血漿 參考依據 長春地辛 長春瑞賓 毒副作用 交叉反應 臨床醫生 臨床治療 特異性強 血漿藥物 樣品處理 長春堿 靈敏度 檢測 給藥 監測 | ||
1.一種長春新堿ELISA檢測方法，其特征在于，步驟包括：
(1)長春新堿人工免疫原和包被抗原的制備；其制備步驟為：
1)長春新堿加入20-30％肼乙醇溶液中，室溫下反應24小時，過濾，減壓濃縮去溶劑，300-400目硅膠柱層析分離，得到4-去乙酰-長春新堿，將4-去乙酰-長春新堿和琥珀酸酐溶于無水吡啶中，60℃減壓回流6小時，冷卻至室溫后有白色沉淀生成，過濾，得到4-長春新堿-半琥珀酸酯；
2)取4-長春新堿-半琥珀酸酯和載體蛋白溶解在pH 8.0緩沖液中，充分震蕩使其溶解，再取乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，充分溶解于pH 8.0緩沖液中；
3)將得到的4-長春新堿-半琥珀酸酯和載體蛋白混合溶液邊震蕩邊滴加入乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液，在搖床上37℃反應4小時，再用Sephadex柱分離偶聯產物和未結合的小分子，經過透析、純化、凍干后即得；
(2)長春新堿抗體的制備；
(3)利用長春新堿抗體與包被抗原組合，建立ELISA檢測方法。
2.根據權利要求1所述的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的載體蛋白質為卵清蛋白、多聚賴氨酸或鑰孔血藍蛋白。
3.根據權利要求1所述的ELISA檢測方法，其特征在于，長春新堿人工免疫原免疫動物，得到長春新堿抗體，所述的免疫動物為大鼠、小鼠或兔。
4.根據權利要求1所述的ELISA檢測方法，其特征在于，步驟包括：(1)將制備的長春新堿包被抗原溶于包被緩沖液中，包被于96孔板上；(2)用100-200μL 5-10％的脫脂乳封閉96孔板，60-90分鐘；(3)洗板、拍干后，向孔中加入50-100μL待檢含長春新堿的血漿，50-100μL長春新堿抗體稀釋液，37℃反應60-90分鐘；(4)洗板、拍干后向孔中加入50-200μL酶標二抗溶液，37℃反應30-60分鐘；(5)洗板、拍干后向孔中加入底物顯色溶液，顯色，終止反應。
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