[發(fā)明專利]大麥抗葉銹病蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510312223.6
• 申請(qǐng)日: 2015-06-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105294845B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 漆小泉;王亞軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): C07K14/415
• 分類號(hào): C07K14/415;C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

本發(fā)明公開(kāi)了與大麥抗葉銹病相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)B；所述蛋白質(zhì)A為序列1所示的蛋白質(zhì)或其氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與抗葉銹病相關(guān)的蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)B為序列2所示的蛋白質(zhì)或其氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與抗葉銹病相關(guān)的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，同時(shí)表達(dá)Rlr1基因和Rlr2基因的轉(zhuǎn)基因大麥植株，其對(duì)葉銹病的抗性明顯加強(qiáng)。本發(fā)明在經(jīng)濟(jì)作物，特別大麥的遺傳改良等行業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及兩種與大麥抗葉銹病相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)

葉銹病是一種分布非常廣泛的麥類作物病害，世界上大多數(shù)小麥和大麥生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。在大麥生產(chǎn)中通常的年份大麥葉銹病可造成30％的減產(chǎn)，流行年份減產(chǎn)可達(dá)60％。研究與實(shí)踐證明，利用抗病基因和培育抗病品種是防治作物葉銹病最經(jīng)濟(jì)、安全、有效和環(huán)保的措施。

要應(yīng)用抗病基因，首先先克隆抗病基因。近年來(lái)植物抗病基因的克隆方法隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步也不斷地在發(fā)展。目前植物抗病基因的克隆的主要方法有圖位克隆技術(shù)，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)，基因同源克隆技術(shù)，RNA水平的差異顯示技術(shù)以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)等等。圖位克隆技術(shù)是一種非常有效的克隆抗病基因的方法，但是由于需要大量的基因型及表型鑒定工作，因此它是一種非常耗時(shí)耗力的技術(shù)，尤其是對(duì)麥類作物這種基因組龐大且復(fù)雜的植物。由于基因組龐大而復(fù)雜，且遺傳轉(zhuǎn)化效率較低等因素的限制，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)也同樣不適合麥類作物。而基因的同源克隆技術(shù)不能用來(lái)發(fā)現(xiàn)新的抗病基因。基于RNA水平的基因差異表達(dá)技術(shù)在抗病基因的克隆和研究中發(fā)揮極大的作用，例如可以運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)或者基因芯片技術(shù)分析接種病原微生物前后的基因表達(dá)情況就可以找到接種前后有差異表達(dá)的抗病基因。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，RNA水平的表達(dá)分析可以通過(guò)更為簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

第二代測(cè)序技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的第一代測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序速度快，數(shù)據(jù)量大，操作流程自動(dòng)化，成本成本低廉等優(yōu)勢(shì)。目前代表技術(shù)有Illumina公司的Solexa技術(shù)，ABI公司的SOLiD技術(shù)，Roche公司的454技術(shù)；能夠同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序。

Solexa測(cè)序技術(shù)最早使用Solexa公司研發(fā)，后被Illumina公司收購(gòu)，其測(cè)序儀命名為Illumina Genome Analyzer。2010年，Genome Analyzer IIx升級(jí)到HiSeq^TM2000，目前已經(jīng)升級(jí)到HiSeq^TM2500。Solexa測(cè)序技術(shù)的核心原理是邊合成邊測(cè)序的方法(sequence bysynthesis,SBS)。Solexa測(cè)序技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是速度快，數(shù)據(jù)量大，成本相對(duì)低廉；但是序列讀長(zhǎng)較短。

Roche公司的Roche(454)GS FLX測(cè)序儀是在焦磷酸測(cè)序法(Hyman,1988)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。其原理是通過(guò)DNA合成時(shí)釋放的焦磷酸分子與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP；ATP再和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光，進(jìn)而判斷堿基類型。基本流程包括：首先生成連有接頭的測(cè)序文庫(kù)；然后將DNA片段與水油包被的直徑大約28μm的磁珠在一起孵育、退火，emulsion PCR生成測(cè)序所需的模板；最后將磁珠顆粒放置在PicoTiterPlate(PTP)的小孔中，每個(gè)小孔僅能容下一個(gè)磁珠顆粒，再加入DNA聚合酶和dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)；采用焦磷酸測(cè)序法獲得序列信息。Roche(454)測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是序列讀長(zhǎng)長(zhǎng)，可達(dá)400bp以上；缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物長(zhǎng)度。