[發明專利]一種能夠特異性結合癌細胞中的DKK1蛋白的適配子

在審

• 申請號: 201510303692.1
• 申請日: 2015-06-07
• 公開（公告）號: CN104830867A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 楊洋
• 申請（專利權）人: 楊洋
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫學檢測領域，具體涉及一種能夠特異性結合癌細胞中的DKK1蛋白的適配子。

背景技術

DKK1編碼一種分泌蛋白，其在脊椎動物發育至關重要的作用，并且是被稱為Wnt信號通路的結腸癌細胞的負調節。DKKl是Wnt信號通路的抑制因子，最早克隆于1998年，發現其在非洲爪蟾早期發育中能夠抑制fct誘導的軸的復制而參與頭部的形成。Wnt通路是一條對胚胎發育起重要調節作用的信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、細胞極性和運動等過程，其通路中信號分子的突變或異常表達與多種疾病及癌癥相關。fct通路受幾種分泌蛋白的調控，包括DKK、WIF(ffnt-1nhibitor?factor)和?SFRP(secreted?frizzled?related?protein)等。DKK?家族包含進化上相對保守的4個成員(DKK1-4)。DKKl編碼一個分泌型糖蛋白，含有兩個富含半胱氨酸的保守區域(Cysl、Cys2),能夠與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6?(low_densitylipoprotein?receptor-related?protein?5/6,LRP5/6)結合，并在膜蛋白?Kremenl/2?參與下通過引起LRP5/6內吞,抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6復合體的形成,而抑制經典的fct信號通路。已知在10種不同類型人腫瘤細胞培養上清中檢測出高濃度的DKKl蛋白，提示多種人腫瘤細胞分泌和高表達DKKl，DKKl可用于人類惡性腫瘤的臨床血清診斷。而且，最新的研究表明ＤＫＫ１蛋白（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１）可作為腫瘤標志物用于肝細胞癌（ＨＣＣ）的血清診斷，可用于篩檢甲胎蛋白（ＡＦＰ）陰性患者，對肝臟良、惡性疾病有較好的區分效用。因此，對DKK1蛋白進行特異性的檢測具有較好的應用價值。

核酸適配子(aptamer)是一種生物大分子的人工單鏈寡核苷酸配體,通過SELEX(Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment)技術從隨機單鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。SELEX技術（即系統進化指數富集技術）是20世紀90年代初研制/發展起來的一種新的組合化學技術，其運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，結合體外PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，獲得親和力高、特異性強的核苷酸適配子（aptamers)。該技術己成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、藥物、?蛋白質、氨基酸以及各種細胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具許多優勢：a.本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學合成，節約成本。b.具有比抗體更高的親和性和特異性。c.便于標記，可以在不同部位有選擇性的標記。d.重復性好，?穩定性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配子/SELEX技術具有良好的應用前景，特別是在抗體工程領域。消減SELEX技術是識別癌與非癌細胞間微小差異、?篩選癌細胞特異性親和適配子的有力工具。

核酸適配子篩選的基本步驟如下:設計并合成隨機單鏈寡核苷酸文庫；將文庫與靶標共孵育，使文庫中能與靶標特異性結合的寡核酸與靶標形成復合物，分離復合物并洗脫寡核酸，以洗脫的寡核酸為模板進行PCR擴增，制備成新的單鏈隨機寡核苷酸文庫，開始下一輪篩選；重復數輪孵育-洗脫-擴增，與靶標高特異性和高親和力結合的核酸序列將從文庫中篩選出來并被指數富集；對最后一輪篩選后制備的文庫進行克隆、測序，其中長度及兩端序列與文庫相符者即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標結合的特異性和親和力，選出能高特異性和高親和力結合靶標者，即可應用于靶標的檢測分析。

發明內容

本發明的目的是提供一種DNA適配子，能夠特異性結合癌細胞中的DKKl蛋白，可以來實現癌的診斷與治療。

本發明采用以下技術方案：

體外合成一個含有38個隨機序列的單鏈DNA文庫，通過體外轉錄構建出單鏈DNA適配子隨機文庫；以人DKKl蛋白其為靶蛋白，采用SELEX技術篩選具有高親和力的表面抗原特異性DNA適配子；通過結構預測軟件RNA?Structure?Program分析預測適配子的二級結構；通過膜結合測定實驗、凝膠阻滯實驗鑒定篩選適配子對靶蛋白的特異性和親和力，得到了多個與表面抗原親和力高、?特異性強的適配子。所述的適配子都能形成各自的特異莖環結構。所述適配子能特異性、高親和力地結合癌DKK1蛋白。所述適配子序列如下：