[發明專利]一種綠僵菌氧甲基轉移酶及其應用

有效

• 申請號: 201510296768.2
• 申請日: 2015-06-02
• 公開（公告）號: CN104862326B
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 徐玉泉;劉航;張維;張禮文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12P7/22;C12P17/08
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種從綠僵菌中得到的氧甲基轉移酶。本發明還涉及該氧甲基轉移酶在苯二酚內酯類化合物生物合成中的應用。

背景技術

聚酮化合物具有抑菌殺蟲、抗癌、降血脂、抑制免疫活性等生物活性，苯二酚內酯類化合物是其中一大類，在臨床和農用藥物等方面具有很大的應用潛力。合成苯二酚內酯類化合物需要兩個基因：還原型聚酮合酶基因和非還原型聚酮合酶基因，這兩個基因總稱為苯二酚內酯類化合物合成基因。

天然的苯二酚內酯聚酮化合物修飾改可以為藥物的更新、改造提供一條途徑。比如有些苯二酚內酯類物質骨架形成后，其結構需要經過修飾，才能形成最優的藥用化合物，氧甲基化修飾就是其中一種修飾作用。苯二酚內酯類化合物合成后修飾已成為了新藥開發的熱點研究方向。

通過化學反應進行修飾存在很多弊端，比如生產周期長，產物種類較多，分離成本較高，使用的試劑多具有強腐蝕性，環境污染嚴重。即使是目前研究先進的分子篩催化劑也無法兼具穩定性高、催化活性活性好、選擇性特異等優點?；瘜W法修飾的這些不足嚴重限制了藥物更新、改造的速度，生物酶法可以避免這些問題。

綠僵菌(Metarhizium anisopliae)基因組測序后，注釋出許多預測基因。但目前尚未有其關于作用底物廣泛的氧甲基轉移酶方面的報道。

發明內容

本發明的目的是得到一種新的氧甲基轉移酶基因，以用于對某些苯二酚內酯類化合物進行修飾。

金龜子綠僵菌(MetarhiziumanisopliaeARSEF23)基因組測序后，注釋出許多預測基因。通過信息學分析，本發明從中獲得了一個氧甲基轉移酶基因，并命名為MaOMT。該基因共999bp，由207個氨基酸縮水形成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由MaOMT編碼的氧甲基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明通過實驗證實了該氧甲基轉移酶MaOMT的催化活性，并且發現該酶可以作用于多個底物，這種作用底物廣泛的氧甲基轉移酶還未見報道。

所述氧甲基轉移是用甲基(-CH₃)取代羥基(-OH)上的氫原子，形成氧甲基基團(-OCH₃)。催化該過程的酶稱為氧甲基轉移酶(O-methyltransferase)。

具體來講，本發明應用該氧甲基轉移酶已經成功實現了兩種化合物的氧甲基化修飾。這兩種化合物分別是：14,15-Dehydrozearalenol和Desmethyl-Lasiodiplodin,修飾后分別成為：3-oxymethyl-14,15-Dehydrozearalenol和Lasiodiplodin,見下式:

經實驗證實，本發明發現的氧甲基轉移酶識別苯二酚內酯類化合物后，能夠在特異的位點進行氧甲基修飾。具體內容包括：

1)基因克?。阂跃G僵菌基因組為模板，以MaOMT F和MaOMT R為引物擴增MaOMT基因，構建到表達載體PRS425M上，命名為PRS425M-MaOMT；

MaOMT F：5’-CTTCATATGAGATCCTACTCATTGGATATCGTCC-3’

MaOMT R：5’-TCCGTTTAAACTTAACCTCTTTTCAATCTTGCTTC-3’

2)酵母轉化：

將合成Desmethyl-lasiodiplodin的還原型聚酮合酶基因、非還原型聚酮合酶基和PRS425M-MaOMT質粒共轉化到酵母細胞中；Desmethyl-lasiodiplodin還原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Desmethyl-lasiodiplodin非還原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示

將合成14,15-Dehydrozearalenol的還原型聚酮合酶基因、非還原型聚酮合酶基和PRS425M-MaOMT質粒共轉化到酵母細胞中；14,15-Dehydrozearalenol還原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，14,15-Dehydrozearalenol非還原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示

3)酵母轉化子培養和提取

在營養缺陷型培養基(-Trp，-Leu，-Ura)中培養。發酵后用乙酸乙酯抽提產物；

4)產物結構分析