[發(fā)明專利]一種產(chǎn)L-肉堿的大腸桿菌基因工程菌及構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510278530.7
• 申請日: 2015-05-27
• 公開（公告）號: CN104928225B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃嬌芳;孫立潔;陳祥松;袁麗霞;王紀(jì);吳金勇;朱薇薇;王剛;姚建銘;史吉平;魏東
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L?肉堿的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法和用途。所述基因工程菌是通過將編碼巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化為L?肉堿的三個關(guān)鍵基因caiB、caiC和caiD連同轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因caiT和正調(diào)控子caiF一起轉(zhuǎn)入大腸桿菌中過表達(dá)，通過厭氧啟動子控制或IPTG誘導(dǎo)L?肉堿合成相關(guān)基因的表達(dá)，同時刪除大腸桿菌自身的編碼異檸檬酸脫氫酶磷酸酶/激酶的aceK基因。基因工程菌經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)后，收集菌體作為全細(xì)胞酶源，直接轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿生成L?肉堿，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，L?肉堿產(chǎn)量最高可達(dá)30g/L以上，摩爾轉(zhuǎn)化率最高為42％，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率比野生株提高了60倍以上，達(dá)到國內(nèi)報(bào)道的生物法制備的領(lǐng)先水平。本發(fā)明的基因工程菌對底物的轉(zhuǎn)化效率高，酶反應(yīng)工藝簡單，生產(chǎn)原料成本低廉，節(jié)約資源，無污染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L-肉堿的大腸桿菌基因工程菌及構(gòu)建方法和用途，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-肉堿(左旋肉堿，L-Carnitine)又稱維生素B_T，是一種維生素制品，與動物體內(nèi)脂肪酸代謝有關(guān)。當(dāng)動物因先天性或代謝性疾病引起體內(nèi)肉堿缺乏時，會使機(jī)體乏力和產(chǎn)生許多心血管疾病。目前L-肉堿除了以強(qiáng)化營養(yǎng)方式用于嬰兒和體弱多病者外，還作為藥物用于降低血脂、減肥和醫(yī)治心血管疾病，由于其療效顯著正引起人們的極大興趣與關(guān)注。近年來，L-肉堿被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健和食品等領(lǐng)域，被瑞士、法國、美國和世界衛(wèi)生組織規(guī)定為法定的多用途應(yīng)用劑，具有很大的應(yīng)用市場。

L-肉堿的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、直接提取法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法等。目前，國內(nèi)主要采用化學(xué)合成法生產(chǎn)，首先合成DL-混旋肉堿，然后進(jìn)行拆分得到L-肉堿，該方法環(huán)境污染較大，并且D-肉堿副產(chǎn)物廢棄造成資源浪費(fèi)。而直接從牛肉等提取法，成本太高產(chǎn)量太低，幾乎沒有應(yīng)用價值。微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法是最有應(yīng)用價值的方法，目前商業(yè)化使用的底物主要有γ-丁基甜菜堿和巴豆甜菜堿。CN101014709A使用粗糙脈孢菌來源的γ-丁基甜菜堿羥化酶，利用γ-丁基甜菜堿為底物進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-肉堿，該方法涉及的酶純化步驟繁多，酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)輔助因子眾多，生產(chǎn)成本太高。CN101068925將來源于粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉(zhuǎn)移酶、6-N-三甲基賴氨酸羥化酶、3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶、γ-三甲基氨基醛脫氫酶與γ-丁基甜菜堿羥化酶等五個編碼基因構(gòu)建到大腸桿菌的T7過表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌BL21(DE3)體內(nèi)，在含有賴氨酸的培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-肉堿的產(chǎn)量為19.8mg/L。巴豆甜菜堿為底物的轉(zhuǎn)化方法有其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，底物便宜，且可利用拆分廢物D-肉堿進(jìn)行脫水制備，但一般菌株均不耐巴豆甜菜堿，需經(jīng)過大量的篩選工作獲得高耐受性的菌株。EP0457735A1使用篩選的奇異變形桿菌能轉(zhuǎn)化底物濃度為12％的巴豆甜菜堿生成L-肉堿，摩爾轉(zhuǎn)化率為40～43％，轉(zhuǎn)化率有待提高。而采用全細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿可以克服菌株對底物的高濃度不耐性，如CN96117166.9使用大腸桿菌的紫外誘變株對巴豆甜菜堿進(jìn)行轉(zhuǎn)化，L-肉堿產(chǎn)量最高達(dá)15～20g/L，轉(zhuǎn)化率為40～50％，此值還達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)水平，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)L-肉堿的大腸桿菌基因工程菌及構(gòu)建方法和用途。通過基因重組技術(shù)獲得具有高轉(zhuǎn)化活性的大腸桿菌基因工程菌，并結(jié)合全細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化，大大提高L-肉堿產(chǎn)量，達(dá)到生物法制備L-肉堿的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的領(lǐng)先水平。

本發(fā)明通過以下方案來實(shí)現(xiàn)：