[發(fā)明專利]CIK細胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510277069.3
• 申請日: 2015-05-27
• 公開（公告）號: CN105018423A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發(fā)明（設計）人: 邊曙光
• 申請（專利權）人: 貴州北科泛特爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

技術領域

本發(fā)明涉及生物科學技術領域，尤其是一種CIK細胞培養(yǎng)方法。

背景技術

隨著腫瘤免疫學的發(fā)展，越來越多的研究表明，殺傷細胞過繼免疫治療對于消除殘留的腫瘤病灶、促進患者免疫系統(tǒng)的重建具有良好的效果，并逐步成為化學治療和造血干細胞移植后清除殘留腫瘤細胞的重要治療手段。CIK?細胞是?1991?年?schmidt?wolf?等報道的一類由多種細胞因子誘導的殺傷免疫活性細胞CIK?細胞表面同時表達有?CD3+分子和?CD56+分子，所以兼有T?淋巴細胞較強大的抗腫瘤活性和自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合物限制性（MHC）殺瘤優(yōu)點，其效應細胞為?CD3+CD56+細胞，是具有不同特異性的T?細胞受體的異質(zhì)群體，具有非?MHC?限制的溶細胞活性對腫瘤細胞。

CIK細胞是一群來源于血液T細胞的異質(zhì)性細胞群體，通過穿孔素和顆粒酶介導的細胞毒作用和增強IL-12、IFN-γ等細胞因子的作用來殺傷腫瘤細胞。

于1991年建立的由IL-1、IL-2、IFN-γ、Anti-CD3Ab等細胞因子組成的“經(jīng)典”的CIK擴增方案目前已被全球眾多的研究者所采納。近年以此為基礎，一些其他的細胞因子也開始被嘗試用于擴增CIK細胞，如Anti-CD28、IL-15、IL-24、SCF、FLT3L等。

白細胞介素?15（IL-15）的生物學作用與?IL-2?相似，是維持和促進效應?T?淋巴細胞的增殖的細胞因子，研究總結(jié)了?IL-15?生物學特性：誘導?T、B?和自然殺傷（NK）細胞的分化和增殖；增強?CD8+T?細胞的細胞溶解活性；誘導產(chǎn)生持久的抗原刺激?CD8+?CD44hi?記憶性?T?細胞；刺激?B?細胞的分化和免疫球蛋白的合成；誘導樹突狀細胞的成熟，但無刺激免疫調(diào)節(jié)性?T?細胞（Treg?細胞）活性。另有研究表明，IL-15?在機體內(nèi)自身也具有強大的抗腫瘤作用，而不需要通過?NK?細胞和?CD8+細胞介導。

IL-21?是?IL-2?細胞因子家族最新發(fā)現(xiàn)的成員，分子結(jié)構與?IL-15?相似，參與調(diào)節(jié)?B?細胞增殖，協(xié)同?IL-15?促進骨髓前體細胞增殖和?NK?細胞增殖、分化和細胞毒活性，由活化的?CD4+T?細胞分泌，利用攜帶?IL-21?基因的慢病毒轉(zhuǎn)染至?CIKs?細胞內(nèi)，可以增加?CIK?細胞?IL-21R、穿孔素、顆粒酶?B、FasL、IFN-γ及?TNF-α?的分泌及表達，主要是激活?JAK-STAT?信號轉(zhuǎn)導途徑來提高?CIK?細胞的抗白血病活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種CIK細胞培養(yǎng)方法，它的細胞擴增比例高，成本低廉，穩(wěn)定性好。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：CIK細胞培養(yǎng)方法，從已經(jīng)取得的外周血100ml中，用生理鹽水懸浮的方式分離出單個核細胞，并種植于T75培養(yǎng)瓶中，加入20mlAIM-V培養(yǎng)基，再加1000u/ml?IFN-γ，在體積濃度為5%的CO2，37℃下的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；再加?100ng/ml?單克隆抗體?CD3及500u/ml?IL-2?，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天；每隔?2?天補加?500u/ml?IL-2，同時加50ng/ml?的?IL-15，或加?100ng/ml?的?IL-21，或加25ng/ml?的IL-15?及50ng/ml?的?IL-21；擴增至第?10?天收獲?CIK?細胞。

所述的培養(yǎng)過程中，每隔2天倍加換液，半量種入新T175培養(yǎng)瓶中，并全量補充上述細胞因子。

由于采用了以上技術方案，本發(fā)明采用新因子體系進行CIK細胞培養(yǎng)，細胞擴增比例超過使用傳統(tǒng)擴增方法所獲得的比例，且因子的使用量較小，降低了細胞培養(yǎng)成本，增加了培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，使用效果好。

附圖說明，

圖?1不同細胞因子對外周血?T?淋巴細胞增殖作用，

具體實施方式，

本發(fā)明的實施例1：CIK細胞培養(yǎng)方法，

1、分離外周血單個核細胞（PBMC），