[發明專利]培養人胎盤間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201510277006.8
• 申請日: 2015-05-27
• 公開（公告）號: CN105018421A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發明（設計）人: 邊曙光
• 申請（專利權）人: 貴州北科泛特爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

1.一種培養人胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)?使用無菌止血鉗剝除胎膜的羊膜層，將胎盤蛻膜部分剪下，放入新的培養皿中，用生理鹽水洗滌3次；

2）將剪取剝離好的胎盤蛻膜放入離心管中，每10ml加入含有10ul頭孢哌酮鈉注射液及兩性霉素b抗生素的基礎培養液作為組織備份；從胎盤上分離的胎盤蛻膜組織，置于含10ml生理鹽水的培養皿中；

3）將上述分離下來的組織胎盤蛻膜組織收集于離心管中，加入45ml生理鹽水于50ml離心管中，離心500g/5min，洗滌1-2遍，棄上清，剪碎成1～4mm³大小的組織塊；

4）向剪碎的組織塊中加入膠原酶II，剪碎的組織塊與膠原酶的體積比為1：3；充分混勻后，置于恒溫振蕩器中，溫度為37℃，轉速為150rpm，時間為1h；

5）在反應完成后，加入消化體積3-5倍的生理鹽水，充分混勻；將消化后的混合液立刻過濾，并將組織塊洗滌1-2次；細胞濾液300g/10min離心，用移液管吸取去掉上清；加入10ml完全培養基，其中含10ul頭孢哌酮鈉及兩性霉素b，吹打后轉入培養瓶：

6）壁蛻膜組織按每1mL組織塊對應接種1個T75細胞培養瓶，將細胞接種到3個T-75培養瓶中，每瓶含有10mL含抗生素的培養液，其中含10ul頭孢哌酮鈉及兩性霉素b；將培養瓶水平放入?37℃，質量百分比為?5%的?CO₂培養箱中進行原代培養；

7）原代培養24-48h后，進行第一次全量換液，此后每隔3天全量換液一次，放置在培養箱中進行培養；

8）原代培養7-14天后，在原代培養的細胞融合度達到80-90%時，消化收獲；收集培養基900g，并進行5min離心；用10-20?mL?的生理鹽水清洗T-75培養瓶1次；加入質量百分比為0.125%的復溫胰酶3mL；在顯微鏡下觀察，直至有80%的細胞變圓脫落漂浮，即用離心后的培養基上清終止消化，消化過程在室溫條件下進行4-6min；

9）將細胞懸液收集到一個50mL離心管中；用10-20?mL?的生理鹽水清洗T-75培養瓶，洗液也收集到該50mL離心管中；用100μm細胞過濾器過濾后，300g離心10min，去上清，加生理鹽水吹勻細胞，定容至20mL混勻，取0.5mL細胞懸液進行計數，其余細胞懸液離心300g/10min；

10）如果P1活細胞總數低于1.5x10⁷，則按上述方法再傳代一次；其中活細胞總數包括凍存細胞總數及流式送檢數；

11）收集最后離心洗滌上清液，送檢需氧菌及真菌、厭氧菌及真菌檢測；用適量完全培養基重懸細胞團塊，并混合均勻。