[發(fā)明專利]檢測細胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器及其制備方法

有效

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• 申請日: 2015-05-26
• 公開（公告）號: CN104965011B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王平;鐘隆潔;顧陳磊;孫嘉弟;王君;蘇凱麒;鄒玲;王琴;方佳如
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析細胞生理代謝的傳感器技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測細胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)

活體細胞對外界刺激如藥物、環(huán)境因素變化和受體作用等產(chǎn)生響應，會引起細胞代謝等功能性變化，外在表現(xiàn)為生化參數(shù)的改變。在分解代謝過程中，活體細胞將吸收代謝物質(zhì)(糖、氨基酸、脂肪酸等碳源)，產(chǎn)生能量(ATP)并且釋放出酸性產(chǎn)物。已有研究證實酸化率(即H⁺濃度變化率)與細胞的生理狀態(tài)密切相關(guān)。細胞胞外氧化還原電位(即細胞外微環(huán)境的氧化還原狀態(tài))，反應了自由電子的活性，與細胞的增殖、分化、凋亡及癌細胞侵蝕都有著密切的關(guān)系。

利用微型化電化學生物傳感器，可以將細胞培養(yǎng)在傳感器表面，細胞內(nèi)的生理變化引起胞外環(huán)境的變化，胞外的電解質(zhì)溶液與傳感器之間形成電化學池，從而將這些參數(shù)的變化通過二級換能器轉(zhuǎn)換為電信號輸出，最終實現(xiàn)定量化監(jiān)測和細胞水平的分析。

由于各種細胞生化參數(shù)檢測的原理和技術(shù)的差異性較大，并且同時檢測存在相互干擾的問題，目前成熟的技術(shù)仍以單一參數(shù)檢測為主，例如基于光尋址電位傳感器的胞外酸化率檢測，具有特異性高靈敏度，已有非常成功的商業(yè)化產(chǎn)品，例如美國分子器件公司生產(chǎn)的微生理計。此外，主流的集成傳感器僅對各個檢測單元進行物理整合，各個單元的功能相互獨立，制備過程復雜，通常體積較大，不易實現(xiàn)細胞水平的檢測。再加之一些檢測技術(shù)在安全性和小型化方面的局限性，限制了其在細胞檢測方面的應用，例如胞外葡萄糖濃度的檢測，常用技術(shù)為采用電流型葡萄糖傳感器，需要在工作電極上施加一定的電壓，對細胞造成不可避免的損傷，而采用傳統(tǒng)的電位型傳感器雖然可以避免施加電壓，但其靈敏度和分辨率又無法達到細胞水平的測量要求；氧化還原電位檢測通常采用傳統(tǒng)大電極，其檢測靈敏度較低，且體積大難以封裝。

多參數(shù)聯(lián)合檢測有利于從多個角度反映細胞的生長代謝狀況和對外界刺激的反應，目前還沒有出現(xiàn)在同一個測試腔體中對細胞的能源消耗、代謝產(chǎn)物以及自由電子活性進行同時檢測的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測細胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器及其制備方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種檢測細胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器，包括：傳感芯片、芯片PCB板、外置導線、外置電極和細胞培養(yǎng)測試腔體。

所述傳感芯片具有硅基底，硅基底背面具有三個光源照射窗口，三個光源照射窗口之間間隔至少1mm，在硅基底正面與光源照射窗口相對應的位置分別設(shè)有第一敏感區(qū)域、第二敏感區(qū)域和第三敏感區(qū)域，在除第一敏感區(qū)域、第二敏感區(qū)域和第三敏感區(qū)域外的硅基底上表面通過離子注入或擴散形成重摻雜層，在硅基底正面覆蓋薄氧化層，作為H⁺離子敏感材料；在薄氧化層表面第二敏感區(qū)域?qū)奈恢酶采w第一金屬層，作為氧化還原電位敏感材料；在薄氧化層表面第三敏感區(qū)域?qū)奈恢酶采w復合膜，作為葡萄糖的敏感材料；所述復合膜由第二金屬層上電鍍聚吡咯和葡萄糖氧化酶的混合物形成；傳感芯片邊緣具有一焊盤，焊盤通過導線與第二金屬層相連；第一金屬層和復合膜的上表面、薄氧化層上第一敏感區(qū)域?qū)奈恢靡约昂副P均暴露于傳感芯片表面，其他區(qū)域均覆蓋Si₃N₄絕緣層；硅基底背面的非窗口區(qū)域覆蓋鋁電極；所述芯片PCB板上具有第一接口焊盤、第二接口焊盤、第一引線、第二引線、第一引腳和第二引腳，所述第一接口焊盤的形狀和尺寸與傳感芯片背面相同，并在光源照射窗口的相對應位置開有透光孔；第一接口焊盤通過第一引線與第一引腳相連，第二接口焊盤通過第二引線與第二引腳相連；第一引腳和第二引腳位于芯片PCB板的邊緣；所述外置導線一端連接在傳感芯片的焊盤上，另一端連接在第二接口焊盤上；所述細胞培養(yǎng)測試腔體的內(nèi)側(cè)壁開有凹槽，所述外置電極固定在凹槽內(nèi)。

一種檢測細胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備背面光源照射窗口：選擇電阻率為8～10Ω·cm的P型硅片作為硅基底，清洗烘干之后，在硅基底背面旋涂光刻膠，經(jīng)紫外曝光顯影，采用濕法腐蝕，蝕刻出光源照射窗口，光源照射窗口頂部的硅基底剩余厚度為100μm；

(2)制備重摻雜層：在1000℃高溫擴散爐內(nèi)，通干氧，硅基底正面熱氧化生長一層厚氧化層，厚度800～1000nm，隨后在厚氧化層上旋涂一層光刻膠，經(jīng)紫外曝光顯影，采用濕法腐蝕去除正面暴露的氧化層，然后采用離子注入或擴散法形成P+重摻雜層，與此同時，P+重摻雜層表面也會有少量氧化層形成；