[發明專利]一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法

在審

• 申請號: 201510271513.0
• 申請日: 2015-05-26
• 公開（公告）號: CN104830840A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 馬愛軍;商曉梅;王新安;夏丹丹;毛美霖
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李素紅

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體地涉及一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法。

背景技術

半滑舌鰨(Cynoglossus?semilaevis?Günter)是我國第一種進行人工養殖的舌鰨科魚類，俗稱牛舌頭、鰨目、鰨米、龍利，屬鰈形目Pleuronectiformes、舌鰨科Cynoglossidae，自然分布于我國沿海海區，以渤海、黃海為多，棲息于泥沙質海底，是一種名貴的底棲大型魚類，目前，由于具有良好的市場經濟價值，有“富貴魚”、“海洋中的黃金”之稱。但是半滑舌鰨的攝食習性非常特殊,習慣夜間攝食，對顆粒飼料采取底匍攝食,明顯不同于鲆鰈類養殖品種牙鲆和大菱鲆等采取投喂后主動從池底躍起攝食的習性。這種特殊的攝食行為,使人工養殖條件下的投喂非常困難,攝食差、死亡率高并表現出生長緩慢現象,這已成為制約半滑舌鰨推廣養殖的瓶頸。因此,探索半滑舌鰨的攝食行為,對于促進其攝食以及為其他鰨科魚類的養殖開發提供借鑒,都具有重要的理論意義和經濟意義。近年來，半滑舌鰨攝食行為和感覺生理成為研究熱點。前期研究表明半滑舌鰨的側線系統在攝食行為中起主導作用。半滑舌鰨的側線系統是由覆蓋在有眼側皮膚的管道神經丘和只分布在無眼側頭部皮膚的游離神經丘兩部分組成，而半滑舌鰨的活體皮膚具有管道神經丘以及游離神經丘，是從分子水平探索半滑舌鰨攝食行為和感覺生理的重要實驗材料。

目前，很多研究都針對改良RNA的提取方法，對前處理方法涉及很少，有關半滑舌鰨皮膚組織的獲取的探索研究更是少之又少。研究發現半滑舌鰨皮膚黏液腺發達，各黏液腺通過黏液分泌管相互連結，并通過無數個開孔通向皮膚表面，致使魚體半滑舌鰨皮膚表面覆蓋厚厚的粘液，同時肌肉剝離困難，易混入肌肉中的RNA，因此要從半滑舌鰨魚體中獲取單一皮膚組織存在很多困難，。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，該方法所需費用極低，材料易得，操作簡便，效果顯著。利用本方法可快速、高效的獲得半滑舌鰨皮膚組織，用于獲取高質量的皮膚RNA；為半滑舌鰨皮膚功能基因的相關研究提供了重要且可靠的分子實驗材料。

一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，包括以下步驟

(1)首先用1×PBS緩沖液清洗魚體表面，去皮膚表面覆蓋的粘液；

(2)在選取的皮膚部位，利用解剖刀切入深度為1.8-3.0mm方塊，所述方塊面積大約為0.25-4cm²，且不要脫離魚體；

(3)利用移液槍向步驟(2)中1.8-3.0mm深的方塊四周裂口處注滿4％多聚甲醛溶液，固定處理1min-4min；

(4)然后吸取4％(g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所處理的方塊皮膚表面，固定處理30s-1min；

(5)選取方塊的一角，用鑷子直接撕取該組織塊表面皮膚，獲取的皮膚組織能夠直接用于RNA的提取或冷凍保存。

本發明與現有技術相比的有益效果：

1、本發明所需材料主要是1×PBS緩沖液和4％多聚甲醛溶液，材料易獲取，需用量極少，費用較低。

2、本發明首次利用固定液的固定特性，第一能夠有效去除半滑舌鰨皮膚表面的粘液蛋白，并減少其分泌；第二能夠使肌肉組織固定變硬，致使皮膚組織與肌肉組織剝離，可以干凈快速獲取半滑舌鰨單一皮膚組織。與常規方法相比一方面能夠簡易快速獲得皮膚組織，而且有效減少了粘液蛋白含量，能夠顯著降低了皮膚RNA降解；另一方面皮膚中不會殘留肌肉組織，能夠得到更純的皮膚RNA，獲得更可靠的后續實驗結果。

3、本發明首次利用4％(g/100ml)多聚甲醛溶液能夠更好的保存RNA完整性的特性，短時間內基本不會破壞RNA的完整性，能夠獲得高質量的RNA。

附圖說明

圖1：本發明方法提取的RNA電泳圖。

圖2：本發明方法與常規方法獲取半滑舌鰨皮膚組織提取RNA比對效果圖：1，、2，、3、4代表常規方法提取的RNA；5和6代表本發明方法提取的RNA。

具體實施方式

下面通過實施例來對本發明的技術方案作進一步的改進，但本發明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。

實施例

一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，具體方法如下(本實驗所需試劑和耗材均需RNA-free，所用的魚為剛剛死亡的半滑舌鰨，體長37cm，體重750g)；

(1)首先用1×PBS緩沖液清洗魚體表面，此步驟盡量除去皮膚表面覆蓋的粘液；