[發明專利]一種大豆抗原β-conglycinin的檢測方法

在審

• 申請號: 201510271439.2
• 申請日: 2015-05-25
• 公開（公告）號: CN104897902A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 趙元;鮑男;張詩堯;秦貴信;張曉東;娜仁高娃
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 合肥順超知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 34120
• 代理人: 楊天嬌

技術領域

本發明屬于食品及飼料安全檢測領域，具體涉及一種大豆抗原β-conglycinin的檢測方法。

背景技術

大豆中含有豐富的蛋白質和平衡的氨基酸，是人和畜禽優質的植物性蛋白源。但其中含有的抗原蛋白導致人和動物的過敏反應的現象越來越受到人們的關注。

大豆抗原是指能大豆中引起人及幼齡動物發生過敏反應的一類蛋白，其中β-conglycinin是主要的大豆抗原蛋白之一，使得大豆抗原蛋在食品及飼料行業中的廣泛應用得到了阻畜禽生產中由于攝入含有大豆的日糧后能夠引起仔豬和犢牛等幼齡動物呈現腹瀉、生長受阻、腸粘膜細胞增生等過敏反應的現象普遍存在礙。因而尋求準確、簡單、陳本低，快速檢測大豆抗原蛋白的方法對于評價食品及飼料安全性有著重要的現實意義。

目前，檢測大豆抗原蛋白的方法主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫印跡、聚合酶鏈式反應(PCR)及高效液相色譜法。高效液相色譜法在使用上比較消耗時間并且儀器相對昂貴，不適合實際生產中的應用；蛋白質免疫印跡的檢測手段具備一定的準確性，但是在試驗的過程中需要消耗的時間比較長，并且試驗成本比較大，因此在一些常規的生產檢測中受到了限制；PCR技(Polymerase?Chain?Reaction)，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，但在后期在使用DNA含量、質量和提取量等等技術過程中都會使PCR技術受到影響，PCR檢測過程中，任何影響DNA含量、質量和提取量的因素均會影響PCR技術的使用，因此就阻礙了此項技術發展和推廣。

以上方法均具有一定的高效性和敏感性，但費用高，耗時長，不?適于生產中大量樣品的快速分析。酶聯免疫吸附試驗，可進行定性或定量分析，具備操作簡單、快速、適于批量檢測等優點已得到了廣泛的認可，目前常見檢測方法有雙抗夾心法和競爭法，但這些方法需要較多的蛋白標準品及其抗體，檢測成本較高，其中間接競爭夾心ELISA方法由于步驟較繁瑣，且浪費抗原試劑，故不適合于食品及飼料行業的大批量檢測。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供一種大豆抗原β-conglycinin的直接ELISA檢測方法，本發明檢測方法具有樣品前處理相對簡單、快速、成本低、儀器化程度低、耗時短等特點，可應用于大豆及其深加工產品中大豆球蛋白含量的檢測，適用于現場監控和大量樣本篩查。

(二)技術方案

本發明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來是實現:

一種大豆抗原β-conglycinin的檢測方法，所述檢測方法為直接ELISA檢測方法，步驟為：

1)包被樣品：用包被緩沖液稀釋成濃度為20ng/ml～640ng/ml的β-conglycinin，同時做空白孔和陰性對照孔，在底板的反應孔中加100μl，4℃過夜，次日，棄去孔內溶液，用洗滌液洗滌ELISA反應板3-5次，每次3min～5min；

2)封閉：每孔加入封閉液于37℃封閉1h，同上洗滌三次；

3)加樣：加入不同濃度的β-conglycinin多克隆抗體與相應的抗原結合，每孔100μl，置37℃孵育1h，然后洗滌；

4)加酶標二抗：將酶標二抗用抗體稀釋液稀釋5000倍，取100μl加入不同反應孔中，37℃孵育1h，洗滌；

5)加底物液顯色：于各反應孔中加入配制好的TMB底物溶液100?μl，37℃反應15min～25min；

6)終止反應：加2M硫酸，每孔50ul，終止ELISA顯色反應；?

7)讀取OD值：在酶標儀上，于492nm處，測各孔OD值，以陽性對照約為1.0，陰照小于0.1，且陽性/陰性(P/N)≥2的條件作最適條件，據此選擇包被抗原和一抗體的工作濃度。

一種大豆抗原β-conglycinin的檢測方法，所述直接ELISA檢測方法是將大豆抗原β-conglycinin兔多克隆抗體作為一抗，將羊抗兔作為酶標二抗，將TMB作為底物進行直接ELISA檢測法，以定量檢測大豆溶液中β-conglycinin的含量。