[發明專利]一種基于氧化石墨烯和納米金的單堿基突變檢測方法

在審

• 申請號: 201510271333.2
• 申請日: 2015-05-22
• 公開（公告）號: CN104964934A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 鄭斌;程盛;朱金苗;姚東寶;梁好均;朱文娟
• 申請（專利權）人: 合肥師范學院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種單堿基突變檢測方法，具體為一種基于氧化石墨烯和納米金的單堿基突變檢測方法，屬于DNA分子檢測技術領域。

背景技術

單堿基突變是DNA或RNA中的序列堿基的替換而產生的一種基因變異種類，這種突變的堿基將會影響到DNA的功能而產生各類遺傳疾病。人類基因組中1％的等位基因會出現單堿基突變，因此對其的早期診斷以達到對特定遺傳疾病的治療具有至關重要的作用。研制具有快速、簡單且具有高靶向性的單堿基突變檢測方法非常有價值和必要。

目前已經報道的單堿基突變檢測的方法有很多種，如microarray-based?sequencing，primer?extension，ligation-based?method，enzyme?invasive?cleavage等酶輔助的方法以及DNA雜交的方法。酶輔助方法具有很高的靈敏度以及強的特異性，但酶抗外界穩定性差，操作過程復雜和嚴格的實驗條件等缺點，限制了其在復雜樣品檢測中的應用。DNA雜交由于在測試過程中無需酶的參與，抗環境干擾能力大大提升，同時由于堿基互補配對具有很強的特異性，實現了單堿基突變的檢測。

在DNA雜交檢測單堿基突變的方法中，主要集中在對某個點的檢測而對于突變位置的檢測卻鮮有報道。目前已報道的突變位置的檢測均是通過內嵌染料進行的電化學的方法[Ankan?Dutta?Chowdhury，Nidhi?Agnihotri，Amitabha?De，Munna?Sarkar.Sensors?and?actuators?B：Chemical?2014，202，917-923；T.Garcia，M.Revenga-Parra，H.D.Abruna，F.Pariente，E.Lorenzo，Analytical?chemistry，2008，80，77-84.]，要利用電化學工作站對由于突變點的存在而產生的電化學信號的變化進行捕捉，而其他方法并未見可對突變點位置進行檢測。

發明內容

本發明要解決上述技術問題，提出一種基于氧化石墨烯和納米金的單堿基突變檢測方?法，將具有單堿基突變的DNA序列與其正常互補序列進行配對修飾于納米金粒子上，利用由于DNA序列存在單堿基突變點位置的不同而產生的空間位阻效應和靜電作用達到調控納米金與氧化石墨烯吸附作用，因此不僅可以檢測單堿基突變，也能達到對突變位置的檢測，以解決背景技術中繡制紋路困難的技術問題。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

本發明提供一種基于氧化石墨烯和納米金的單堿基突變檢測方法，利用DNA修飾過的納米金對氧化石墨烯的吸附具有差異來檢測單堿基突變，將雙鏈DNA接枝到納米金粒子表面，利用具有修飾的納米金在氧化石墨烯上吸附動力學的差別，實現用紫外分光光度計實時研究單堿基突變的狀況。

本發明的步驟為：首先將3μM?DNA與10nM納米金在Tris-HC1且pH＝7的緩沖液中孵育，然后加入1M?NaCl鹽溶液，待沉降后離心15000rpm?30min。其中，3μM?DNA與10nM納米金在Tris-HCl且pH＝7的緩沖液中孵育時間為8小時。

將將一次孵育所得溶液離心15000rpm?30min的溶液再加入3μM待測DNA，然后進一步二次孵育8小時，再對孵育8小時后的溶液離心15000rpm?30min。

將二次孵育所得溶液加入95.2μg/mL氧化石墨烯，然后立即進行紫外光譜動力學測定，測定520nm處吸光度變化，判斷單堿基突變是否突變以及突變點的位置。

與現有技術相比，本發明具有的有益效果是：本發明為一種基于氧化石墨烯和納米金的單堿基突變檢測方法，實現了對突變點位置的檢測，不需要復雜儀器，僅用紫外分光光度計即可實現定位，用比色法可實現定性分析。

具體實施方式

以下本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。

一種基于氧化石墨烯和納米金的單堿基突變檢測方法，其特征在于，利用DNA修飾過的納米金對氧化石墨烯的吸附具有差異來檢測單堿基突變，將雙鏈DNA接枝到納米金粒子表面，利用具有修飾的納米金在氧化石墨烯上吸附動力學的差別，實現用紫外分光光度計實時研究單堿基突變的狀況。

首先將3μM?DNA與10nM納米金在Tris-HCl且pH＝7的緩沖液中孵育，然后加入1MNaCl鹽溶液，待沉降后離心15000rpm?30min。其中，3μM?DNA與10nM納米金在Tris-HCl?且pH＝7的緩沖液中孵育時間為8小時。