[發明專利]一種蘋果酸酶基因及其重組表達載體

有效

• 申請號: 201510270913.X
• 申請日: 2015-05-26
• 公開（公告）號: CN104894147B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 高春紅;張琦;李凌彥;魏云林;林連兵;季秀玲
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種蘋果酸酶基因及其重組表達載體，具體涉及從深黃被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中克隆的蘋果酸酶基因以及將該基因直接與不同載體連接，轉入不同宿主細胞中，利用其編碼蘋果酸酶催化蘋果酸脫羧，伴隨著產生丙酮酸、CO₂和NADPH，其產生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促進脂肪酸的合成等功能，屬于微生物基因工程領域。

背景技術

蘋果酸酶（malic enzyme，ME）是調控蘋果酸代謝的關鍵酶，可以催化蘋果酸進行氧化脫羧，伴隨著產生丙酮酸和CO₂以及NAD(P)⁺的還原。蘋果酸酶廣泛存在于動物、植物、真菌和細菌中。根據輔酶因子的不同，蘋果酸酶可分為兩種：NAD-蘋果酸酶（NAD-Malic enzyme，NAD-ME，EC 1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-蘋果酸酶（ NADP-Malicenzyme，NADP-ME，EC 1.1.1.40）。本發明主要是針對NADP- 蘋果酸酶基因進行研究。

通常認為，NADP-ME為各種細胞組分的合成提供還原力NADPH。例如在產油微生物油脂合成代謝調控中，NADP-ME持續為脂肪酸合成酶進行鏈延伸提供NADPH（Song Y D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-蘋果酸酶在植物的生長代謝及發育過程中也扮演著重要角色，植物中蘋果酸酶的底物和產物參與多種代謝途徑，包括光合作用和呼吸作用。如熱帶C4植物中的固碳作用，保持植物細胞的滲透勢，穩定細胞質的pH 和保持植物根系的離子吸收平衡起重要作用，是生物體生命活動中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters, 2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D,Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被認為參與植物防御反應。另有報道表明，NADP-ME 參與了果實的成熟，通過蘋果酸代謝來平衡細胞內的pH，還通過代謝提供碳源和NADPH 調節一些底物及輔助因子來參與脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代謝途徑（CAM）植物的一種重要脫羧酶，酶活性晝高夜低；兼性CAM植物隨著C3光合型向CAM型轉化，其NADP-ME酶活性涿漸升高，干旱誘導CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性調節中起重要作用。在CAM運行和調節中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一樣，具有重要調節作用(王晨，西北植物學報，1997，17（2）: 200-204.)。

蘋果酸酶作為生物體中樞代謝途徑的關鍵酶，也可應用于厭氧混合酸的發酵工程及釀酒工業。因此本發明通過發掘高效、特異性新蘋果酸酶基因MIME1，進一步將其插入pET-32a(+)構建重組表達質粒，并實現在E.coli BL21中表達重組蘋果酸酶，為蘋果酸酶應用于工業和農業奠定基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種從深黃被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中分離的蘋果酸酶基因MIME1及該基因編碼的氨基酸，該基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO：1互補的核苷酸序列，該基因序列長為1821bp（堿基），其中1-1821為編碼蘋果酸酶成熟多肽的開放閱讀框；該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其片段。

本發明另一目的是提供一種含有所分離的蘋果酸酶基因MIME1的重組表達載體，是將SEQ ID NO：1所示基因直接與不同表達載體（質粒、病毒或運載體）連接所構建的重組載體。

本發明另一目的是提供一種含有該蘋果酸酶基因MIME1或上述重組表達載體的宿主細胞大腸桿菌（Escherichia coli）菌株BL21。