[發明專利]一種測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法

有效

• 申請號: 201510266988.0
• 申請日: 2015-05-25
• 公開（公告）號: CN104830947B
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發明（設計）人: 江雪飛;喬飛;穆大偉;黨選民;叢漢卿;王靜
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙)44295
• 代理人: 王洪娟

1.一種測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）選取植物幼嫩組織，破碎后，向破碎材料中加入酶解液混勻，在黑暗條件下震蕩酶解植物幼嫩組織的細胞壁；

（2）酶解后過濾，收集濾液，清洗，離心，棄上清，獲得原生質體懸浮液，并在原生質體懸浮液中加入水解酶以保持細胞壁纖維素的低水平再生；

（3）將加入水解酶的原生質體在亞低溫或亞高溫條件下溫浴，溫浴結束后，加超純水以降低溶液滲透勢，定時測定原生質體的直徑；

（4）用步驟（3）獲得的原生質體的直徑值，計算多個原生質體單位時間、單位滲透勢、單位面積細胞膜上水分從細胞外進入細胞內的凈速度Lp的平均值，該Lp平均值和所選植物適宜溫度下的Lp值差值越大，說明其亞低溫或亞高溫耐受性越差；

步驟（1）中所述的酶解液為纖維素酶和離析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纖維素酶的濃度為2~3%w/v，離析酶R-10的濃度為0.5~1%w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的濃度為0.3~0.5mol/L，酶解液的用量與植物幼嫩組織的用量關系為1~5mL：0.2~2g；

或步驟（1）中所述的酶解液為纖維素酶、離析酶R-10和果膠酶的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纖維素酶的濃度為2.5~3%w/v，離析酶R-10的濃度為0.5~1%w/v，果膠酶的濃度為0.1~0.2%w/v，甘露醇或蔗糖水溶液的濃度為0.3~0.5mol/L，酶解液的用量與植物幼嫩組織的用量關系為1~5mL：0.2~2g；

步驟（1）中震蕩酶解時的溫度為22~28℃，速度為70~100 r/min，酶解時間為100~160 min。

2.根據權利要求1所述的測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是：步驟（2）中過濾用140~180目的尼龍網過濾，清洗采用甘露醇或蔗糖水溶液，其濃度為0.3~0.5 mol/L，離心時離心機的離心力為5×g ~30×g，離心時間為3~10 min，并重復清洗、離心、棄去上清一次。

3.根據權利要求1所述的測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是：步驟（2）中所述的水解酶為纖維素酶和離析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纖維素酶的濃度為0.8~1.2%w/v，離析酶R-10的濃度為0.2~0.4%w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的濃度為0.3~0.5mol/L，水解酶用量與原生質體重懸液的體積比為1:10~20。

4.根據權利要求1所述的測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是：步驟（3）中所述的亞低溫或亞高溫條件指：當用于亞低溫耐受性測定時，以所選植物生長適宜溫度下限減去3~5℃或8~10℃為梯度，獲得亞低溫溫度區間；當用于亞高溫耐受性測定時，以所選植物生長適宜溫度上限加上2~5℃或8~10℃為梯度，獲得亞高溫溫度區間。

5.根據權利要求1所述的測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是：步驟（3）中溫浴時間為20~40min，超純水的加入量為加入水解酶的原生質體總體積的0.5~2倍。

6.根據權利要求1所述的測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是：步驟（4）中至少計算90個原生質體單位時間、單位滲透勢、單位面積細胞膜上水分從細胞外進入細胞內的凈速度Lp的平均值。

7.根據權利要求1或6所述的測定植物亞低溫或亞高溫耐受性的方法，其特征是：步驟（4）中每個原生質體單位時間、單位滲透勢、單位面積細胞膜上水分從細胞外進入細胞內的凈速度Lp的計算公式為：Lp=(Vt₂-Vt₁)/[(t₂-t₁)×S×D_osm]，

其中，V t₂為t₂時間點原生質體的體積；V t₁為t₁時間點原生質體的體積；S為t₁時間點原生質體的表面積；D_osm為加超純水稀釋前后滲透勢的差值；

D_osm由以下公式計算獲得：

當滲透調節物質為甘露醇時：Y=1.1736X；

當滲透調節物質為蔗糖時：Y=1.4155X；

其中Y為滲透壓度，單位為mM/Kg，X為酶解液或水解酶中采用的滲透調節物質甘露醇或者蔗糖水溶液的濃度，單位為mM。