[發明專利]一種口服酵母攜帶DNA片段作為新型水產口服DNA疫苗的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201510266475.X
• 申請日: 2015-05-22
• 公開（公告）號: CN104857507B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 張智英;閆娜娜;劉玉萬;張小晗;李欣憶;韓寶泉;陳知龍
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K48/00;A61K38/38;A61K39/39;A61K47/46;A61P37/04;C12N1/19;C12N15/85;C12N15/12
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

本發明一種由口服酵母攜帶DNA片段活體靶向水產動物腸道免疫細胞，誘導水產動物產生免疫反應的制備方法。該疫苗生產成本低，使用方法簡單，適合大規模生產，而且與傳統減毒疫苗相比對動物無毒力威脅。可用在魚類貝類等水產動物的多種細菌性、病毒性和寄生蟲等口服DNA疫苗的開發應用上，使水產動物健康生長，減少水產業在疾病方面的損失，同時避免目前DNA疫苗所存在的弊端。

技術領域

本申請涉及一種酵母攜帶DNA片段的口服DNA疫苗，屬于基因工程領域。

背景技術

DNA疫苗是指將病原體抗原基因插入可在真核生物體內表達的質粒中獲得重組質粒，將該質粒DNA接種給魚體后，質粒能夠在其體內復制、轉錄、翻譯成相應的抗原蛋白，并以不同的路徑和方式刺激魚體的免疫系統從而產生針對該抗原的免疫應答起到持續的免疫保護作用。

與傳統的魚類疫苗相比，DNA疫苗制備過程簡便，且效率較高，具有減毒疫苗的優點，又無逆轉的危險，因此越來越受到科研工作者的重視。目前魚類DNA疫苗均采用肌肉注射，但是肌肉注射作為DNA疫苗最為有效的免疫方式耗時耗力，在實際運用中存在一定的局限，不適合在規模化魚類養殖中推廣應用。相比之下，口服免疫安全方便，不受魚體大小的限制，因此，口服DNA疫苗更具實用優勢。目前為止，全世界只有針對魚感染性造血壞死病毒的DNA疫苗在加拿大獲得許可并投入商業化使用，國內被許可的應用于水產的商品化口服DNA疫苗還未見報道。

針對口服疫苗，有效的載體則能夠避免保護性抗原在魚體消化道內被消化而保證疫苗的免疫效果。酵母作為一種食用微生物長期被用于制備食物如面包、饅頭，以及啤酒，具有安全性高的特點；酵母的細胞壁含有大量葡聚糖，是一種優質的免疫多糖；酵母具有較強的免疫佐劑效應；重要的是，研究證明酵母對胃腸的分泌物有較強的抵抗能力。因此，酵母是一種理想的口服疫苗的載體。

發明內容

本發明一種由口服酵母攜帶DNA片段活體靶向水產動物腸道免疫細胞，誘導水產動物產生免疫反應的制備方法。該疫苗生產成本低，使用方法簡單，適合大規模生產，而且與傳統減毒疫苗相比對動物無毒力威脅。可用在魚類貝類等水產動物的多種細菌性、病毒性和寄生蟲等口服DNA疫苗的開發應用上，使水產動物健康生長，減少水產業在疾病方面的損失，同時避免目前DNA疫苗所存在的弊端。

雞卵白蛋白ovalbumin(OVA)是一個很好的模式抗原，經常用于多種免疫研究中。本研究以OVA基因為例，所述重組酵母含有真核基因表達載體pRS426-CMV-OVA，該表達盒在酵母中不表達，但可在哺乳動物細胞中表達。真核基因表達載體可以作為酵母質粒隨酵母細胞進行復制。將該重組酵母混合到魚飼料中飼喂25g左右紅鯽，免疫14天后就能在紅鯽血清中檢測到特異性抗體的產生，21天抗體達到峰值。本研究證明了口服酵母可以攜帶DNA片段靶向魚類免疫細胞引起免疫反應。在此過程中，酵母不僅發揮了呈遞抗原的功能，同時還扮演了佐劑的角色。本發明具有應用基因工程酵母作為DNA運送載體，靶向調控水產動物腸道免疫細胞的功能，將本實驗所用載體的OVA片段可以替換為多種水產動物病毒或細菌等抗原基因，能夠應用于新型口服DNA疫苗開發和生產，實現對水產動物免疫的調節、疾病預防與治療。

附圖說明

圖1：PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中,泳道M為Trans2K Plus DNAMarker；泳道1,2為CMV和OVA基因片段的PCR擴增產物。

圖2：pRS426-CMV-OVA載體的質粒圖譜。

圖3：pRS426-CMV-OVA，并經SacII/BamHI/XhoI酶切圖，其中泳道M為DNA Marker；泳道1為pRS426-CMV-OVA經SacII/BamHI/XhoI酶切的產物