[發(fā)明專利]利用水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評價水質(zhì)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510260490.3
• 申請日: 2015-05-21
• 公開（公告）號: CN104899475B
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳學(xué)萍;張旭;顧卿;葉丹華;鄭毓;何池全
• 申請（專利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類號: G06F19/20
• 分類號: G06F19/20
• 代理公司: 上海上大專利事務(wù)所(普通合伙)31205
• 代理人: 顧勇華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評價水質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，由于沉積物和上層水體頻繁地進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)和污染物質(zhì)的交換，沉積物中代謝過程極大地影響了水體的水質(zhì)。水體的大部分微生物棲息于沉積物中，不斷進(jìn)行各種有機(jī)物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，是食物鏈中的重要生產(chǎn)者。因此，微生物具有對環(huán)境條件變化的敏感性，微生物群落對水質(zhì)變化的生態(tài)效應(yīng)主要是某些指標(biāo)種（對某種污染有耐性或敏感的種類）的出現(xiàn)或消失、個別種群的變化、微生物群落中種類或類群的增減及改變等，而這些生態(tài)效應(yīng)都集中體現(xiàn)在沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性方面的變化，可以利用微生物組成與多樣性變動評價水質(zhì)。

由于微生物監(jiān)測具有傳統(tǒng)理化監(jiān)測所不可替代的優(yōu)越性，不僅能反映環(huán)境污染對生物產(chǎn)生的綜合效應(yīng)和積累效應(yīng)，還可以對儀器無法檢測出的一些低濃度甚至是痕量的污染物，生物可迅速呈現(xiàn)相應(yīng)癥狀。總之，生物學(xué)法具有直觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，不僅反映水質(zhì)的瞬時變化，而且能連續(xù)監(jiān)測水質(zhì)污染，反映低濃度污染物對生物體的潛在危害。

目前我國的河流水質(zhì)的微生物檢測主要以純培養(yǎng)技術(shù)為主，但是水體細(xì)菌的種類較多，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法只能獲得少數(shù)細(xì)菌種類，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展與完善，克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法通量低、準(zhǔn)確率低等缺點(diǎn)，可以更加全面、準(zhǔn)確、快速地反映環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，從而可以更加客觀地認(rèn)識環(huán)境中微生物原位的生態(tài)狀況。因此，為了更好地促進(jìn)河流水質(zhì)管理，今后我國應(yīng)采用理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)全面評價河流水質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種利用水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評價水質(zhì)的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種水體沉積物中微生物多樣性指標(biāo)評價水質(zhì)的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

1）提取沉積物中微生物基因組DNA；

2）以步驟a提取的DNA作為模板，針對16S rRNA基因的V4可變區(qū)，合成帶有barcode的融合引物如下：

F：5’- Index+AYTGGGYDTAAAGNG-3’，

R：5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3），并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3）將步驟b得到的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶切膠純化，在經(jīng)切膠純化后的 DNA 片段的3’端引入單堿基“A”，連接“Y”字形接頭，該“Y”字形接頭的3’末端含有單堿基“T”，使所述的DNA 片段和接頭能夠通過“A”“T”互補(bǔ)配對連接，后利用PCR 選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，同時擴(kuò)增DNA文庫，測序；

4). 對經(jīng)步驟c測序后的序列進(jìn)行過濾和去除嵌合體，進(jìn)行OTU的聚類和注釋，各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析和物種豐度差異分析，利用微生物指標(biāo)評價因子PA，BGN：β進(jìn)行評價。

計算微生物指標(biāo)評價因子：

根據(jù)Simt et al.（Applied Environmental Microbiology, 2001, 67:2284-2291）計算；

PA值>0.8為富營養(yǎng)，>0.46時為營養(yǎng)豐富，<0.34為寡營養(yǎng)水平。

根據(jù)Garrido et al.（Science of The Total Environment, 2014, 468–469: 1154–1161）計算 ；

其中Bac是擬桿菌門豐度，GmP是γ變形菌門豐度，Nit是硝化螺菌門豐度，BtP是β變形菌門豐度。

BGN:β指數(shù)越高，說明水體污染越嚴(yán)重。BGN:β<0.85，水體水質(zhì)尚清潔，BGN:β>1.3，水體污染較嚴(yán)重。

本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明運(yùn)用微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)能綜合評價水體水質(zhì)，具有很強(qiáng)的敏感性，能更全面地反映水質(zhì)的變化。

2.本發(fā)明應(yīng)用MiSeq Illumina測序技術(shù)可以獲得高通量的基因序列（>3萬條優(yōu)質(zhì)序列/樣品），能獲得客觀全面的微生物群落結(jié)構(gòu)，更直接全面地反映水環(huán)境污染程度。

3.對各類水體的沉積物都可以準(zhǔn)確測定，在時間和空間動態(tài)都能進(jìn)行長期和短期的監(jiān)測，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1 本發(fā)明實(shí)施例一種沉積物基因組DNA。