[發(fā)明專利]氧化石墨烯作為RNA保護(hù)試劑的新應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510249894.2
• 申請(qǐng)日: 2015-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN104805076A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周小明;邢達(dá);廖玉輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于RNA納米保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于氧化石墨烯納米材料吸附功能的RNA保護(hù)策略，該方案能夠有效的阻斷RNA保存過程中酶促降解過程。

背景技術(shù)

核糖核酸(RNA)存在于細(xì)胞及部分病毒、類病毒當(dāng)中，并行使遺傳信息載體的功能。其廣泛參與各項(xiàng)重要的生命歷程，對(duì)于生命活動(dòng)的維系具有重要作用。根據(jù)RNA的功能可將RNA大致分為四類：1)mRNA：即信使RNA，主要功能是將DNA上的遺傳信息精確無誤地轉(zhuǎn)錄下來，以傳遞遺傳信息；2)tRNA：具有特異識(shí)別、轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸功能；3)rRNA：核糖體的重要組成成分。4)microRNA：具有調(diào)控功能。由此可見，RNA在生物體內(nèi)，對(duì)于生物體生命活性具有重要意義。為了實(shí)現(xiàn)RNA功能探索及生理意義相關(guān)研究，通常需要對(duì)RNA進(jìn)行分離純化，并將純化的RNA進(jìn)行冷凍保存。然后，RNA的易降解性使RNA的保存面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前，研究者通常采用添加RNA酶抑制劑的方法，人為添加RNA酶抑制劑到RNA溶液當(dāng)中，以降低或抑制RNA酶的催化活性，從而達(dá)到RNA保護(hù)的目的。但此類方法所需的RNA酶抑制物往往存在成本很高、運(yùn)輸存儲(chǔ)困難、易變質(zhì)、活性不穩(wěn)定等問題。因此，開發(fā)新型的、易儲(chǔ)存運(yùn)輸、活性穩(wěn)定的RNA保護(hù)策略對(duì)于RNA保護(hù)及相關(guān)領(lǐng)域具有重要意義。

近年來，隨著納米技術(shù)的進(jìn)步，納米材料已廣泛運(yùn)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。其中，氧化石墨烯更是成為了“明星”納米材料，并廣泛運(yùn)用于電子學(xué)、材料學(xué)、診斷學(xué)等學(xué)科。眾所周知，氧化石墨烯能夠通過π-π堆疊效應(yīng)，吸附核酸及蛋白質(zhì)，產(chǎn)生固定化作用，而固定化作用導(dǎo)致的分子自由度的變化可能會(huì)引起酶促反應(yīng)過程的巨變，可以產(chǎn)生酶促反應(yīng)過程的阻斷。正如我們預(yù)想的那樣，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在總RNA提取物中加入氧化石墨烯能夠延長RNA的儲(chǔ)存時(shí)間，氧化石墨烯似乎具有RNA保護(hù)功能。由此，我們對(duì)氧化石墨烯的RNA保護(hù)功能進(jìn)行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯通過固定RNA，在其表面形成一個(gè)保護(hù)界面，可以有效的阻止RNA酶對(duì)RNA的降解。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯能夠固定RNA酶，固定后的RNA酶活性明顯降低。因此，氧化石墨烯的RNA保護(hù)功能是通過對(duì)RNA及RNA酶的吸附，阻斷了酶促反應(yīng)過程而實(shí)現(xiàn)的。綜上，本發(fā)明發(fā)展了氧化石墨烯RNA保護(hù)策略，能夠克服當(dāng)前RNA抑制劑保護(hù)方法存在的問題，其易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、性能穩(wěn)定，通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯能夠?yàn)镽NA提供有效的保護(hù)。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有RNA保護(hù)技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種氧化石墨烯作為RNA保護(hù)試劑的新應(yīng)用。本發(fā)明采用在RNA溶液中加入氧化石墨烯的方法，通過石墨烯的吸附作用，使RNA及RNA酶吸附在氧化石墨烯表面，從而使RNA酶的酶促反應(yīng)過程得到抑制，達(dá)到RNA保護(hù)的目的。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

氧化石墨烯作為RNA保護(hù)試劑的新應(yīng)用，包括如下步驟：將氧化石墨烯與RNA樣品或RNA酶進(jìn)行混合，震蕩混勻，并室溫放置5～15分鐘，得到氧化石墨烯RNA混合液或氧化石墨烯RNA酶混合液；使氧化石墨烯充分吸附RNA，達(dá)到保護(hù)RNA的目的；

所述的氧化石墨烯，與RNA樣品的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(1～10)；

所述的氧化石墨烯，與RNA酶的比值優(yōu)選為1μg：(1～40U)；

所述的氧化石墨烯RNA混合液，在常溫下放置4天，RNA基本無降解；

所述的氧化石墨烯RNA酶混合液中，RNA酶活性大大降低，從而降低了RNA酶對(duì)RNA的降解能力。

所述的氧化石墨烯作為RNA保護(hù)試劑的新應(yīng)用，包括以下具體步驟：

1、總RNA提取：

(1)選取單增李斯特菌作為研究對(duì)象，取菌液離心去上清(原則上每10⁷個(gè)細(xì)胞加入1mL?TRIZOL，不能超過10⁸個(gè)細(xì)胞，8000g，4℃離心2min，去掉上清液體，仔細(xì)將上清液吸取干凈，不要觸及EP管底部的細(xì)菌)

(2)加入250μL，20mg/mL的溶菌酶(使用無RNA酶的TE溶解)吹打混勻，放入37℃的水浴鍋或者培養(yǎng)箱中孵育10min。

(3)再加入1mL?TRIZOL裂解液吹打混勻，再使用振蕩器震蕩，放置在常溫下6～10min。(一定要室溫靜置，靜置完畢后可以直接放入-80℃冰箱保存)。

(4)往步驟(3)中已經(jīng)備好的裂解液中加入氯仿(TRIZOL?1/5的體積量，一般200μL左右，最多300μL)蓋緊離心管蓋，劇烈震蕩，直到將混合液乳化成乳白色狀態(tài)。室溫靜置5min。