[發明專利]琥珀酸的新型微生物生產者和琥珀酸的純化

有效

• 申請號: 201510246300.2
• 申請日: 2010-02-12
• 公開（公告）號: CN104877935B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: H·施羅德;S·哈夫納;G·馮阿本德羅特;R·霍爾曼;A·拉達茨;H·恩斯特;H·古爾斯基
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/46;C12P7/56;C12P7/54;C12P7/40;C12P17/04;C12P7/18;C12P17/10;C07C51/47;C07C51/42;C07C55/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

本發明涉及能夠利用甘油作為碳源發酵生產琥珀酸的細菌菌株，其中所述菌株是經過遺傳修飾的，使其包含失調的內源性丙酮酸?甲酸?裂解酶活性，并涉及利用此類微生物生產有機酸，特別是琥珀酸的方法。本發明還涉及通過陽離子交換層析對所生產的有機酸的下游加工。

本申請為2010年2月12日提交的，發明名稱為“琥珀酸的新型微生物生產者和琥珀酸的純化”的PCT申請PCT/EP2010/051798的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2011年8月16日，申請號為201080007963.4。

本發明涉及能夠利用甘油作為碳源發酵生產琥珀酸的細菌菌株，其中所述菌株是經過遺傳修飾的，使其包含下調的內源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此類微生物生產有機酸，特別是琥珀酸的方法。

發明背景

從生物質發酵生產琥珀酸(SA)已引起了廣泛關注，因為所述酸是合成樹脂的重要成分，或者是其他有價值的低分子化學化合物的來源，特別是四氫呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁內酯(GBL)和吡咯烷酮(WO-A-2006/066839)。

Lee等(2002a)描述了從牛的瘤胃分離的SA生產菌。所述細菌是不動的、不形成芽孢的、嗜中溫和嗜二氧化碳的革蘭氏陰性的桿狀或球桿菌。基于16S rRNA序列的系統發生學分析和生理學分析表明所述菌株屬于曼海姆菌(Mannheimia)屬，作為新種，被稱為產琥珀酸曼海姆菌(Mannheimia succiniciproducens)MBEL55E。在100％CO₂條件下，它在6.0-7.5的pH范圍內生長良好，并以2:1:1的恒定比例生產SA、乙酸和甲酸。當CO₂飽和條件下，用葡萄糖作為碳源，無氧培養產琥珀酸曼海姆菌MBEL55E時，在孵育7.5h里，消耗了19.8g/L的葡萄糖，產生了13.3g/L的SA。此外，在該微生物中，通過突變/刪除代謝基因，改善了SA的生產。乳酸脫氫酶IdhA、丙酮酸-甲酸-裂解酶pFlB、磷酸轉乙酰基酶pta和乙酸激酶ackA基因的組合突變/刪除導致菌株將碳轉化為SA的產量(YP/S)為0.6g SA/g添加的碳源。生產SA的時空產量為1.8g/升/h(Lee，2006)。

Lin等，2005描述了在Idh和pfI基因中都攜帶突變的大腸桿菌的變體菌株，稱為SB202。然而，該菌株的特征是生長緩慢，且在無氧條件下不能完全發酵糖類。失活的Idh和pfI導致碳流動被限制于丙酮酸節點，導致丙酮酸作為主要產物積累。在該方面，發現基于碳源的琥珀酸的碳產量(YP/S)低于0.15g/g SA/碳。

Sanchez等，2005描述了在Idh、adhE、ack-pta和icIR基因中攜帶突變的大腸桿菌菌株。在這些實驗中，細胞有氧的生長在復雜培養基上，在有氧條件下收獲、濃縮和用碳源孵育。在這些用于將碳水化合物直接轉化為SA的特定條件下，發現碳產量YP/S為0.98至1.13g SA/g碳源，時空產量為0.79g/l h SA。在好氧轉化階段前的生物量生產的碳利用明確的不包括在該計算中，且未進行進一步描述。

Hong和Lee(2001)描述了在Idh和pfI基因中攜帶突變的大腸桿菌菌株。這些菌株確能從碳水化合物發酵中生產SA，然而，伴隨緩慢的碳水化合物利用和從碳水化合物碳源葡萄糖的低的SA時空和碳產量(YP/S)。此外，產生琥珀酸、乙酸和乳酸的比例為1:0.034:1.6。在該分析中，與未突變的親本菌株相比，在Idh和pfI基因中攜帶突變的菌株的生長是遲緩的。

Zhu等，2005描述了在pfI基因中突變的E.coli菌株，其不產生琥珀酸，但產生乳酸，當在以葡萄糖為惟一底物的條件下生長時，表現出低下的生長。

然而，生物產琥珀酸曼海姆菌的重要缺陷是它不能代謝甘油，而甘油作為三酰基甘油(TAG)的組分是便于獲得的，例如作為生物柴油生產的酯基轉移反應中的副產品(Dharmadi等，2006)。