[發明專利]一種高效表達高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201510244547.0
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104830747B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 周哲敏;張曉歡;崔文璟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/88;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 張勇

1.一種高產高分子量型腈水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌以E.coli BL21(DE3)為宿主，pET24a(+)為載體，表達腈水合酶；所述腈水合酶由氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的nhhB基因、nhhA基因、調控基因nhhG組成；所述nhhB與nhhA基因、nhhA與nhhG基因均由核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的SD序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的間隔序列按照“SD序列-間隔序列”的方式相連；所述腈水合酶的核苷酸序列是SEQ ID NO.6所示的序列；所述腈水合酶的nhhB基因、nhhA基因、調控基因nhhG的序列根據大腸桿菌密碼子偏好性進行了優化。

2.一種構建權利要求1所述重組大腸桿菌的方法，其特征在于，所述方法是：(1)以NCBI上登錄號為Genbank ID:X86737.1的序列為基礎，將腈水合酶的B、A基因之間以及A、G基因之間的序列替換成SD序列AAGGA和間隔序列GATATAGAT，并根據大腸桿菌密碼子偏好性進行優化得到序列如SEQ ID NO.6所示的nhhB(rbs)A(rbs)G的序列；(2)將上一步得到的序列克隆到表達載體pET24a(+)上，篩選獲得正確的重組質粒pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G；(3)將重組質粒轉化入E.coli BL21(DE3)，篩選得正確的重組菌BL21/pET24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G。

3.權利要求1所述重組大腸桿菌的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述應用是將重組大腸桿菌用于生產腈水合酶。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述應用是將重組大腸桿菌接種于含有16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl的培養基中，于37℃培養至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后加入IPTG和CoCl₂·6H₂O進行誘導，誘導溫度為24℃，誘導16h。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述應用具體是：將重組大腸桿菌接種于含有16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl的培養基中，于37℃培養至OD₆₀₀＝0.8，然后加入終濃度為0.4mM的IPTG和0.1g/L的CoCl₂·6H₂O進行誘導，誘導溫度為24℃，誘導16h。