[發明專利]一種基于多探針富集56基因靶區域的方法

有效

• 申請號: 201510243959.2
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104818336A
• 公開（公告）日: 2015-08-05
• 發明（設計）人: 漢雨生;揣少坤;段飛蝶
• 申請（專利權）人: 廣州燃石醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種基于多探針富集56基因靶區域的方法。

背景技術

在過去的數年里，對NSCLC(非小細胞肺癌)的生物學認知取得進步促使可以識別出對于惡性腫瘤轉化和癌細胞生存至關重要的一些分子事件并形成了潛在治療靶點。近年來，關于針對非小細胞肺癌的靶向治療藥物進展迅速，已獲FDA批準的有EGFR小分子抑制劑吉非替尼，厄洛替尼，ALK小分子抑制劑克唑替尼，色瑞替尼等。值得注意的是，這些靶向治療藥物都只針對攜帶某些特定基因變異的人群有效。如攜帶EGFR?L858R或19號外顯子缺失性突變的非小細胞肺癌患者對第一代EGFR小分子抑制劑敏感。而攜帶ALK融合的非小細胞肺癌患者則對ALK小分子抑制劑敏感。因此，隨著靶向治療藥物的推廣，與之配合的伴隨分子診斷變得必不可少。2015年美國癌癥聯盟(NCCN)指南中建議對非小細胞肺癌患者檢測七項與靶向藥物相關的基因變異：EGFR突變，ALK融合，MET擴增，ERBB2突變，BRAF突變，ROS1突變，以及RET突變。

早期分子診斷采用多種技術平臺，如定量PCR，FISH，免疫組化等，一次檢測一種或幾種基因變異，對同一患者采用順位檢測的方法。傳統方法的局限性在于，由于每次檢測僅限于一種基因，所需的活檢組織量隨檢測基因數的增長而增加。在可預見的未來，將難以滿足檢測所有靶標基因的需求。與此同時，近期有研究表明，肺癌中的重要靶點基因變異并非完全互斥，而是在一小部分患者中并存。Wu?et?al.的研究顯示，中國非小細胞肺癌患者中有1.3％同時攜帶EGFR突變與ALK融合(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24443562)。對于這些患者，對于分子靶點基因變異順序檢測的方法會引起某些基因變異事件的漏檢，從而使醫生對該患者最適宜的靶向治療方法產生可能的誤判。而基于目標區域捕獲的DNA二代測序法可以一次性平行檢測幾十，乃至上百種基因中包括點突變，插入缺失，DNA拷貝數改變，融合重排等多種變異形式，從而一次性檢出所有與靶向治療相關的靶點基因變異，并對于同時并存的基因變異的突變豐度進行估算與排序。因此為突破傳統分子診斷方法的局限提供了新的途徑。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明旨在提供一種多探針富集56基因靶區域的方法，通過設計專用的捕獲探針庫，采用探針捕獲技術一次性富集多個基因多靶點序列，從而實現多基因多靶點并行深度高通量測序。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于多探針富集56基因靶區域的方法，包括如下步驟：

S1?gDNA片段化和加接頭adaptor

1.1)準備所需試劑如下：

SureSelect?QXT終止反應液、SureSelect?QXT緩沖液、SureSelect?QXT轉座酶溶液、二甲基亞砜(DMSO)、AMPure?XP磁珠、乙醇；

1.2)定量待建庫樣本，調整濃度至25ng/μL，體積2μL；

1.3)PCR儀設置DNA片段化程序，設好程序后，點擊開啟，再立即點擊暫停；

1.4)SureSelect?QXT緩沖液和SureSelect?QXT轉座酶溶液分別高速渦旋混勻備用；

1.5)將SureSelect?QXT緩沖液、樣本和SureSelect?QXT轉座酶溶液依次添加到PCR管中，于冰上操作配制片段化反應體系，每種試劑單獨添加；配制完成后，短暫離心，再高速渦旋充分混勻20s，并再次短暫離心，完成后立即將PCR管放置于步驟1.3)中暫停的PCR儀上，重新啟動反應程序；

1.6)PCR完成后，立即將其轉移至冰上；然后往其中加32μL1XSureSelect?QXT終止反應液，高速渦旋5s，短暫離心，室溫孵育1min；

S2?AMPure?XP磁珠純化

2.1)將AMPure?XP磁珠在使用前充分混勻并平衡至室溫；

2.2)將步驟S1中得到的已片段化和加接頭adaptor的樣本轉移至新的1.5mL?EP管中；

2.3)加入52μL充分混勻的AMPure?XP磁珠，渦旋5s，短暫離心，保證磁珠沒有沉底；

2.4)置于混勻儀上室溫孵育5min；

2.5)孵育好的樣本短暫離心，放磁力架上吸附磁珠，時間為3-5min，棄上清；

2.6)加300μL現配的70％乙醇，計時1min，期間沿水平方向緩慢旋轉EP管一圈，令干擾的磁珠下沉，棄上清；

2.7)重復步驟2.6)一次；