[發明專利]一種用于檢測AMACR的雙功能納米探針、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201510240980.7
• 申請日: 2015-05-13
• 公開（公告）號: CN104880424B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 劉景豐;劉小龍;鄭愛仙;曾永毅
• 申請（專利權）人: 福州市傳染病醫院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/68
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司33246
• 代理人: 冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種用于檢測α-甲基酰基輔酶A消旋酶(AMACR)的生物識別與信號引發雙功能納米探針，檢測AMACR的試劑盒以及檢測方法。

(二)背景技術

納米金探針是納米金物理特性與生物分子化學特性的耦合體，通過納米金探針放大檢測信號的途徑主要有銀染、熒光標記、酶標記等，并由此發展了多種檢測途徑，如熒光檢測、分光光度檢測、電化學檢測等。目前許多科研團體都致力于發展納米金探針定性定量的快速免疫測技術。Nam等以檢測抗體和巰基寡核苷酸修飾納米金形成納米金探針，通過銀染反應檢測蛋白質含量，或者用熒光基團修飾納米金探針上的巰基寡核苷酸，通過熒光檢測測定蛋白質含量，同時他們還利用納米金在不同的聚合狀態下顏色會發生顯著變化的特性建立了比色法檢測蛋白質含量的方法。Stoeva等利用納米金探針建立了同時檢測多種蛋白質的方法，表明通過納米金探針可以實現多目標檢測，很有發展價值。這些方法都顯著地提高了蛋白質檢測的靈敏度，但就從臨床應用來說，涉及到銀染或者熒光檢測，操作步驟繁多或儀器昂貴，有礙于推廣應用。

AMACR是一種代謝酶，在支鏈脂肪酸及其衍生物的β氧化中發揮著至關重要的作用。研究表明，AMACR在前列腺癌細胞中過表達，可作為前列腺癌診斷的特異性生物標志物。目前，AMACR的檢測主要是以抗體作為識別元件，而抗體具有制備困難、成本高，制備的批間誤差大，對環 境敏感、易失活等缺點。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種合成簡單、容易修飾、設計靈活的生物識別與信號引發雙功能納米探針，及其在AMACR檢測中的應用，方法簡單、效果良好。

本發明采用的技術方案是：

一種用于檢測AMACR的生物識別與信號引發雙功能納米探針，由納米金粒子(AuNPs)表面同時修飾辣根過氧化物酶和能夠識別目標蛋白的核酸適體制得，所述納米金粒子為球狀結構、粒徑為10～20nm(同時修飾核酸適體和HRP后，納米金的粒徑增大到50～70nm)，納米金粒子與辣根過氧化物酶原料用量之比為7nmol：10～15mg，納米金粒子與核酸適體原料用量之比為7nmol：100～150nmol；修飾所用的核酸適體原料序列：5'-CCTACGGCGCTAACCCATGCTACGAATTCGTTGTTAAACAATAGGCCACCGTGCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3'。該核酸適體末端連接了20個A堿基，以減小空間位阻的影響。

核酸適體是用指數富集的配體系統進化技術(SELEX)從隨機序列庫中篩選出來的一條單鏈DNA或RNA，對其特定識別的蛋白質具有很高的親和力。本發明納米金同時修飾辣根過氧化物酶(HRP)與核酸適體(aptamer)，這樣不僅避免了生物識別分子與信號引發分子之間的共價修飾，還能實現信號放大從而提高檢測效果。

具體的，所述雙功能納米探針可由如下方法制備得到：

(1)取濃度為14nM的AuNPs混懸液用Na₂CO₃調pH值至9.0；

(2)加入濃度為10mg/mL的辣根過氧化物酶溶液，震蕩反應0.5～2h， 離心濃縮至原體積的1/4～1/6，AuNPs混懸液與辣根過氧化物酶溶液體積用量之比為1:0.002～0.003；

(3)加入濃度為100μM的核酸適體溶液，震蕩反應18～28h，AuNPs混懸液與辣根過氧化物酶溶液體積用量之比為1:0.002～0.003；

(4)加入NaCl溶液至其終濃度為0.1M，震蕩反應0.5～2h；

(5)加入牛血清白蛋白至其終濃度為1％，封閉1～2h；

(6)離心、洗滌2～3次，即得所述生物識別與信號引發雙功能納米探針；離心參數如下：13000rpm、30min，洗滌液為10mM、pH7.4磷酸緩沖液。