[發(fā)明專利]大豆花葉病毒抗性基因Rsc8的分子標記及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510230313.0
• 申請日: 2015-05-04
• 公開（公告）號: CN104830849A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王大剛;張磊;黃志平;李杰坤;胡國玉;吳倩
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;A01H5/00
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1.鑒定和篩選大豆花葉病毒抗性基因R_SC8的分子標記，其特征在于：包括分子標記ZL-39和ZL-52；所述分子標記ZL-39和ZL-52與抗性基因R_SC8之間的遺傳距離分別為2.2cM和1.6cM。

2.用于擴增如權(quán)利要求1所述分子標記ZL-39的引物對，其特征在于，所述引物對包括具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列的下游引物。

3.用于擴增如權(quán)利要求1所述分子標記ZL-52的引物對，其特征在于，所述引物對包括具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列的下游引物。

4.鑒定和篩選大豆花葉病毒抗性基因R_SC8的分子標記的制備方法，包括以下步驟：

(1)以待鑒定材料DNA作為模板，利用權(quán)利要求2所述的引物對或權(quán)利要求3所述的引物對進行PCR擴增；其中大豆材料基因組DNA的提取，以苗期新鮮葉片為材料，采用CTAB法提取DNA，詳細步驟如下：

1)取大豆嫩葉2-3g，在液氮中研成粉末，倒入65℃預熱30min左右的裝650μL?CTAB提取緩沖液的離心管中，再加入20μL?β-巰基乙醇，65℃水浴60min左右，期間輕搖3-5次；

2)加入624μL的氯仿和26μL的異戊醇溶液，并充分搖勻，放在搖床上輕搖20min；

3)經(jīng)10000rpm離心15min，將上清液轉(zhuǎn)入一個新的離心管中；

4)加入200μL冰凍的異丙醇，上下?lián)u勻；

5)經(jīng)8000rpm離心5min，倒掉液體，加入1000μL?TE緩沖液，待完全溶解后，加入624μL的氯仿和26μL的異戊醇溶液再抽提一次；

6)經(jīng)8000rpm離心5min，吸取上清液轉(zhuǎn)到一個新的離心管中；

7)加入1000μL的冰凍無水乙醇，在-20℃下靜置20min以沉淀DNA；

8)10000rpm離心5min，棄去上清液；

9)70％乙醇800μL清洗兩次，真空干燥機上吹干；

10)將DNA溶于TE中，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；置于-20℃待用；

(2)PCR擴增：

將權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的分子標記引物對加入PCR反應體系，并對大豆育種群體植株的DNA進行擴增；擴增體系為4.0μL?Taq×Master?PCR?Mix，2.0μL濃度為1.0ppmol/L上下游引物，20.0ng/μL模板DNA?3.0μL，ddH₂O?1.0μL；反應總量10.0μL；PCR程序：94℃預變性5min，每個循環(huán)95℃變性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，12℃保存；

(3)PCR產(chǎn)物檢測：

PCR反應產(chǎn)物在質(zhì)量比8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。

5.權(quán)利要求1所述的分子標記或權(quán)利要求2所述的引物對或權(quán)利要求3所述的引物對在大豆抗大豆花葉病毒材料創(chuàng)制中的應用。

6.權(quán)利要求1所述的分子標記或權(quán)利要求2所述的引物對或權(quán)利要求3所述的引物對在分子標記輔助大豆抗大豆花葉病毒育種中的應用。

7.含有權(quán)利要求2所述的引物對或權(quán)利要求3所述的引物對的試劑盒。

8.權(quán)利要求7所述的試劑盒在大豆抗大豆花葉病毒材料創(chuàng)制中的應用。

9.權(quán)利要求7所述的試劑盒在分子標記輔助大豆抗大豆花葉病毒育種中的應用。