[發明專利]雜交瘤細胞株4F2，其產生的單克隆抗體及應用

在審

• 申請號: 201510220766.5
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN104974257A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 劉鳳權;王利民;方慶奎;蔡佳
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
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技術領域

本發明涉及雜交瘤細胞株4F2、其產生的抗殺螟硫磷單克隆抗體及應用。

背景技術

殺螟硫磷，又名殺螟松，屬有機磷殺蟲劑。毒性中等，對人畜低毒，大鼠急性經口LD50為400-800mg/kg，大鼠急性經皮LD50為1200mg/kg。殺螟硫磷具觸殺和胃毒作用，無內吸和熏蒸作用，殘效期中等，殺蟲譜廣，對鱗翅目幼蟲有特效，也可防治半翅目、鞘翅目等害蟲。在農業生產中應用較廣，對環境及人畜健康造成一定的威脅。因此對農產品中殺螟硫磷的檢測與監測具有一定的意義。

目前，化學農藥的殘留檢測多采用薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等方法。這些方法結果可靠，靈敏度高，已有相關的技術標準可供參考。但由于需要昂貴的儀器、專門的操作人員，以及樣品前處理復雜、成本高、時間長，因此不能更好地滿足快速簡便的現場檢測要求。

免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、特異的優點，便攜而有利于進行現場監測，克服了傳統檢測方法的缺點。已在醫療、食品等多個領域有較大的應用。本發明利用殺螟硫磷免疫半抗原合成人工免疫原，免疫BALB/C小鼠后利用雜交瘤細胞技術篩選出可分泌高效識別農藥殺螟硫磷單克隆抗體的雜交瘤細胞株4F2。通過酶標抗殺螟硫磷單克隆抗體建立針對農產品中有機磷農藥殺螟硫磷的高靈敏度免疫檢測方法(ELISA)：對殺螟硫磷的50％抑制濃度(IC50)為0.01ng/mL，與殺螟硫磷結構類似的農藥如倍硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷等有機磷農藥的交叉反應率均小于0.1％，針對殺螟硫磷在青菜、水和土壤中的添加回收率在85％-100％之間，可用于有機磷農藥殺螟硫磷殘留的快速檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種可穩定分泌抗有機磷農藥殺螟硫磷單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體。

本發明的另一目的是建立可用于農產品中殺螟硫磷殘留快速檢測的高靈敏免疫檢測方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

本發明提供提供了雜交瘤細胞株4F2，該細胞株已于2015年4月10日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO.C201511。

識別有機磷農藥殺螟硫磷的單克隆抗體，由保藏編號為CCTCC?NO.C201511的雜交瘤細胞株4F2分泌產生。該抗殺螟硫磷單克隆抗體可以高效、特異性識別殺螟硫磷，對殺螟硫磷的50％抑制濃度IC50為0.01ng/mL。

本發明提供的雜交瘤細胞株4F2是通過將殺螟硫磷人工免疫原常規免疫BAlB/C小鼠，利用雜交瘤細胞技術將效價最好的小鼠脾細胞與SP2/0進行融合，并利用ELISA方法對獲得的陽性克隆孔進行篩選，最終篩選出陽性值與競爭效果最好的孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，克隆后再次進行篩選，如此反復篩選3-5次之后，最終篩選獲得雜交瘤細胞株4F2。

本發明提供的抗殺螟硫磷單克隆抗體來自于BALB/C小鼠腹腔。該小鼠經過液體石蠟預處理后，注射雜交瘤細胞株4F2，并采集該小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸銨法進行純化，收集得到抗殺螟硫磷單克隆抗體，并應用于殺螟硫磷的免疫檢測方法的建立。

本發明的有益效果在于：

(1)本發明提供的雜交瘤細胞株4F2可以分泌高效識別殺螟硫磷的單克隆抗體，該抗體在酶聯免疫吸附方法(ELISA)中測得的效價可達1.5×10⁵。

(2)本發明提供的識別殺螟硫磷單克隆抗體靈敏度高、特異性好，在建立的免疫檢測方法中對殺螟硫磷的抑制中濃度IC50為0.01ng/mL，與殺螟硫磷結構類似的農藥如倍硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷等交叉反應均在0.1％以下。

具體實施方式

實施例1：雜交瘤細胞株4F2的篩選

1.動物免疫

將殺螟硫磷人工免疫原免疫6周齡的BAlB/C小鼠。第一次免疫將殺螟硫磷免疫原與等體積的福氏完全佐劑乳化后，于小鼠腹腔注射。第二次免疫將殺螟硫?磷免疫原與等體積的福氏不完全佐劑乳化，注射方式與第一次免疫相同，間隔3周。第三、四、五次免疫分別于第二次免疫程序一致，且間隔均為2周。從第3次免疫后，每次免疫后7-8天，小鼠尾部靜脈采血，分離血清，利用間接ELISA檢測小鼠血清效價。最后一次免疫后，對血清進行效價監測之外同時對血清靈敏度進行評價。選擇效價、靈敏度均相對較高的血清所對應的小鼠進行加強免疫，免疫劑量為前面的2倍，不加福氏佐劑，注射方式相同。

殺螟硫磷人工免疫原為殺螟硫磷免疫半抗原與牛血清蛋白的偶合物，殺螟硫磷免疫半抗原的分子結構為：