[發明專利]一種河豚毒素的檢測方法

在審

• 申請號: 201510220110.3
• 申請日: 2015-05-04
• 公開（公告）號: CN104820033A
• 公開（公告）日: 2015-08-05
• 發明（設計）人: 廖永巖
• 申請（專利權）人: 欽州學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 桂林市持衡專利商標事務所有限公司 45107
• 代理人: 湯凌志

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種中國鱟和圓尾鱟體內的河豚毒素的檢測方法。

背景技術

中國鱟主要分布于日本的瀨戶內海和九州島北岸，越南、西菲律賓的島嶼，蘇門達臘和爪哇島，馬來西亞的北婆羅洲以及加里曼丹東岸等海域，在中國主要分布于長江以南的浙江、福建、廣東、廣西、海南以及臺灣等沿海海域，現以福建、廣東、廣西、海南為多。圓尾鱟分布于中國香港、北部灣、雷州灣、印度尼西亞爪哇島北岸以北、菲律賓南部以西和恒河河口印度東北部以東的海域。在我國圓尾鱟主要分布于北部灣、雷州半島西海岸以及海南的西海岸，近年來發現雷州半島南海岸及以東沿岸均有圓尾鱟的分布，如湛江、香港等地不少海灘也分布有不少的圓尾鱟。我國人民素有吃鱟的習慣，鱟肉似蟹，只是口感較粗。在中國的廣東、廣西常有食鱟中毒的事件發生。

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一種毒性很強的神經性毒素，它最早從河豚魚中分離出來的。近年來還發現河豚毒素不僅存在于河豚屬的魚類，還存在于蝦虎魚、章魚、海星、蟹類以及腹足類，甚至還有鱟等眾多的海洋生物中。它們不僅本身有較強的毒性而且可以通過食物鏈富集等途徑，污染其他水產品，給人們食用這些水產品構成極大潛在危險。在東南亞河豚毒素中毒已經成為一個難題，一般都是因為攝取了河豚魚導致的中毒。因為在日本河豚魚被作為一道佳肴，所以大多數的河豚中毒事件都是發生在日本。另外，誤食不明魚種也是此類中毒事件發生的重要原因，因而加強對水產品中河豚毒素的監測顯得尤為必要，多省地方漁業局已將水產品中河豚毒素作為常規檢測項目。河豚毒素的檢測方法種類繁多，有生物測定法、理化檢測方法、免疫化學測定方法等幾大類。小鼠法是最常用和最簡便的方法，廖永巖等也在2000年用小白鼠法檢測了中國鱟和圓尾鱟體內的河豚毒素，但此法具有定量不準確且重復性差等缺點。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測中國鱟和圓尾鱟體內的河豚毒素的方法。

其技術方案如下：

一種中國鱟和圓尾鱟體內的河豚毒素的檢測方法，包括以下步驟：

(1)標準貯備液的配制

精密稱量TTX?1.0mg置于5ml離心管中，用1ml移液槍吸取1.0mL的濃度為0.2％醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX貯備溶液，置于冰箱中保存；

(2)樣品的前處理?

取中國鱟或圓尾鱟待測組織10g，剪碎后加10ml?pH＝3.5濃度為0.1％的醋酸于玻璃勻漿器中勻漿，充分勻漿后將樣品置于燒瓶中，加50ml濃度為0.1％的醋酸，然后在水浴鍋中沸水浴10-20分鐘，邊加熱邊攪拌，轉速控制在150-200r/min，冷卻后用0.45μm濾膜真空抽濾，將濾液放入蒸發皿中，在60-70℃的水浴鍋上進行蒸發濃縮，直至10ml，然后過濾定溶至10ml，將濃縮的濾液10ml放在離心管中，經10000r/min的速度，離心15分鐘，取上清液經0.22μm的微孔濾膜過濾后，放入干凈的離心管中，作為液相色譜待測液；

(3)液相色譜測試?

醋酸流動相色譜條件固定相：SunFire^TMC18色譜柱，直徑4.6mm×長度150mm，進樣量為20μ；流動相：0.2％醋酸；流速：0.8mL/min；紫外檢測波長：210nm；柱溫：25℃；每次進樣體積為60μL；pH為3.0；

磷酸流動相色譜條件固定相：SunFire^TMC18色譜柱，尺寸為4.6mm×150mm，進樣量為20μl；流動相：0.05mol/L?NaH₂PO₄-0.05mol/L?Na₂HPO₄，pH＝6.8，庚烷磺酸鈉離子對5mM；流速：1mL/min；紫外檢測波長為200nm；柱溫：25℃；每次進樣體積為60μL；pH為6.8。

與現有技術相比，本發明的有益效果：

1、本發明采用高效液相色譜法檢測中國鱟和圓尾鱟體內的的河豚毒素，以便證明鱟體內的毒素到底是不是含有河豚毒素，從而知道是食什么鱟引起食鱟中毒以及含量多少，為食鱟中毒的預防和治療提供參考。

2、本發明樣品前處理步驟中，水浴鍋中沸水浴10-20分鐘，邊加熱邊攪拌，轉速控制在150-200r/min，在這一范圍內，物料粘度不會隨著攪拌的進行而增大，如果轉速過高，粘度增大后轉速會逐漸降低會影響河豚毒素的溶出。

附圖說明

圖1是0.2％的醋酸(pH＝3.0)做流動相的河豚毒素標準樣液相色譜圖。