[發明專利]果梅PmARF基因及其應用

在審

• 申請號: 201510219345.0
• 申請日: 2015-04-30
• 公開（公告）號: CN104805094A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 高志紅;宋娟;倪照君;侍婷
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/84;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種果梅PmARF基因，其特征在于：該基因序列如SEQ?ID?NO.1，該基因不僅參與花器官的形態建成，還參與調控植物、植物葉片的衰老速度，是一個多效型轉錄因子。

2.包括權利要求1所述的果梅PmARF基因的表達載體。

3.權利要求2所述表達載體，其特征在于：所述表達載體原始載體為PBI-121載體，在xbaI和SmaI酶切位點引入果梅PmARF基因的cDNA。

4.含有權利要求2或3所述表達載體的工程菌。

5.權利要求4所述工程菌，其特征在于：所述工程菌為農桿菌。

6.權利要求1所述基因或者權利要求2所述表達載體或者4所述工程菌在花器官形態培育中的應用。

7.權利要求1所述基因或者權利要求2所述表達載體或者4所述工程菌在植物改良中的應用，其中，改良方向包括延長植物存活期，提高植物產量。

8.權利要求7所述的應用，其特征在于：所述植物為果梅或者煙草。

9.上述1所述基因在煙草品種改良方法的應用，其特征在于：該應用包括如下步驟：

1)基因開放閱讀框的克隆：根據梅基因組序列Pm019941最大開放閱讀框兩端設計引物，上游引物PmARF11-F，序列如SEQ?ID?NO.2所示，下游引物PmARF11-R，序列如SEQ?ID?NO.3所示；CTAB法提取果梅品種‘大嵌蒂’的總RNA，根據TaKaRa公司反轉錄試劑盒，合成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模板，PmARF11-F、PmARF11-R為引物，PCR擴增，獲得長度為2136bp的cDNA序列，命名為PmARF11；

2)植物表達載體的構建：設計含有xbaI和SmaI酶切位點的特異引物，上游引物PmARF11-MF：序列如SEQ?ID?NO.4所示，下游引物PmARF11-MR：序列如SEQ?ID?NO.5所示，其中，PmARF11-MF含有xbaI酶切位點TCTAGA，PmARF11-MR含有SmaI酶切位點CCCGGG；以PmARF11為模板，PmARF11-MF、PmARF11-MR為引物，PCR擴增，將酶切位點引入PmARF11的基因序列中；PBI-121載體進行xbaI和SmaI雙酶切，獲得酶切大片段；T4連接酶連接引入酶切位點的PmARF11和PBI-121載體大片段，獲得重組植物表達載體PBI-121，PCR酶切鑒定；

3)遺傳轉化：凍融法將重組植物表達載體PBI-121轉化農桿菌EHA105，挑取單菌落于50ml含Km?50mg/L+Rif?50mg/L的YEB液體培養基中28℃，200r/min振蕩過夜培養，菌液PCR鑒定陽性克隆；待陽性克隆的菌體OD600值達到0.5，5000rpm離心10min，棄上清，沉淀用50ml的無菌MS液體培養基重新懸浮培養；利用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，獲得轉基因煙草株系。

10.權利要求8所述應用，其特征在于：步驟(1)中PCR擴增條件為，反應體系，PCR緩沖液，2.5μL；dNTP，2μL；MgCl2，1.5μL；稀釋10倍的cDNA，1μL；上游引物PmARF11-F，0.5μL；下游引物PmARF11-R，0.5μL；rTaq酶，0.2μL；ddH2O，16.8μL；其余用水補齊至25μL；反應流程，94℃，30s，72℃，2min，5個循環；94℃，30s，62℃，40s，72℃，2min，共5個循環；94℃，30s，60℃，40s，72℃，135s共32個循環；72℃，10min；

步驟(2)PCR擴增條件為，反應體系，稀釋10倍的cDNA，1.0μl；5×PrimeSTAR?GXL緩沖液，5.0μl；dNTP，2μL；上游引物PmARF11-MF，0.3μl；下游引物PmARF11-MR，0.3μl；PrimeSTAR?GXL?DNA聚合酶，0.5μl；ddH2O補齊體系至25μl。