[發明專利]一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法

在審

• 申請號: 201510217966.5
• 申請日: 2015-04-24
• 公開（公告）號: CN104777120A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 杜長明;馬丹燕
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于消毒技術領域，特別是提供了一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法。

背景技術

丙二醛(MDA)一般是由于氧自由基攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸(PUFA)后生成的，因此是一種脂質過氧化作用終產物的標志物，并且丙二醛是經過脂質過氧化作用后終產物產生量較多的一種。因此，丙二醛含量被用來檢測細菌經過等離子體處理后的脂質過氧化水平。另外要說明的是丙二醛本身具有細胞毒性，能夠造成DNA損傷，或者是與細胞膜上的受體結合，甚至能夠破壞細胞膜的結構以及功能。因此丙二醛濃度越高，細胞膜中不飽和脂肪酸的含量會越低，最終細胞膜會喪失流動性。也可以用經過等離子體處理后懸浮菌液中丙二醛的濃度來表征自由基與細菌的作用情況。目前國內外對等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的研究甚少。

發明內容

為解決上述問題，本發明提出一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法，主要的機理是：丙二醛本身能夠與TBA發生反應(在高溫和酸性條件下時)生成的物質為紅棕色，然后通過分光光度計檢測其吸光度換算出丙二醛的含量。

本發明為達到以上目的，是通過以下的技術方案來實現的，包括的步驟如下：

(1)、丙二醛標準曲線的測定，稱取97％1，1，3，3-四乙氧基甲烷的丙二醛標準儲備液0.315g，加蒸餾水溶解并在1L容量瓶中定容，然后用稀釋法制作出80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml的丙二醛標準溶液；然后測定0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的丙二醛標準溶液在532nm下的吸光度，以丙二醛濃度(μg/mL)為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制出標準曲線；

(2)、懸浮菌液中丙二醛含量的測定，將經過等離子體處理過的菌膜膜塊放置到10ml磷酸鹽緩沖液中懸浮振蕩，所得液體即為待測液體；在測定之前將每個樣品離心處理，取上清液1ml，加入到編號的試管中，然后在每個試管中分別加入2ml的三氯乙酸溶液，并混合均勻；然后再將混合后的樣品離心處理，取上清液2ml，在加入3ml的硫代巴比妥酸，將樣品混合均勻后放在水浴鍋中水浴10min，其中溫度保持在95℃，待樣品自然冷卻至室溫后測定樣品在532nm處的吸光度值；然后將吸光度值代入到標準曲線中就能計算出對應樣品的丙二醛含量。

附圖說明

圖1為丙二醛(MDA)含量與殺菌效果曲線。

具體實施方式

實施例

在超凈工作臺中，制備含有大腸桿菌菌種(編號：ATTC25922)的菌膜膜塊備用。

(1)、丙二醛標準曲線的測定，稱取97％1，1，3，3-四乙氧基甲烷的丙二醛標準儲備液0.315g，加蒸餾水溶解并在1L容量瓶中定容，然后用稀釋法制作出80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml的丙二醛標準溶液，放置于冰箱中保存備用，注意保存時間不宜超過24h；然后測定0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的丙二醛標準溶液在532nm下的吸光度，以丙二醛濃度(μg/mL)為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制出標準曲線；

(2)懸浮菌液中丙二醛含量的測定，選用空氣微弧等離子體射流作為等離子體發生源，將經過0s、10s、15s、20s、25s、30s等離子體處理過的(處理距離2cm)菌膜膜塊放置到10ml磷酸鹽緩沖液中懸浮振蕩，所得液體即為待測液體；在測定之前將每個樣品離心處理(6000rpm，10min)，取上清液1ml，加入到編號的試管中，然后在每個試管中分別加入2ml的三氯乙酸溶液(質量分數為10％)，并混合均勻；然后再將混合后的樣品離心處理(6000rpm，10min)，取上清液2ml，在加入3ml的硫代巴比妥酸(質量分數0.6％)，將樣品混合均勻后放在水浴鍋中水浴10min，其中溫度保持在95℃，待樣品自然冷卻至室溫后測定樣品在532nm處的吸光度值；然后將吸光度值代入到標準曲線中就能計算出對應樣品的丙二醛含量。實驗結果見附圖1，能夠看到經過等離子體處理后，確實能夠立即造成細胞中脂質過氧化作用，并且在0s處理時間到20s處理時間內，菌液懸浮液中的丙二醛含量逐步上升，在等離子體處理30s后達到了峰值，然后，在30s處理樣品中丙二醛開始下降。這主要是因為在0-30s等離子體處理時，等離子體中的活性物質(主要是ROS)刻蝕細菌的細胞膜，與細胞膜中不飽和脂肪酸發生過氧化反應，從而生成丙二醛，然后由于超過30s后，所有的細菌都已經死亡，說明等離子體對膜的破壞作用已經很嚴重，此時大量的不飽和脂肪酸被消耗，丙二醛的生成量減少，然后丙二醛在等離子體的作用下開始轉化或者分解。表現為丙二醛含量開始下降，可以預測，隨著等離子體處理的時間進一步延長，丙二醛含量會繼續下降。另外，當丙二醛大量生成后，由于細胞裂解，一部分DNA釋放出來，丙二醛本身也能造成DNA的損傷而造成細菌死亡。