[發(fā)明專利]一種利用外源動(dòng)物線粒體DNA檢測地溝油的方法

有效

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• 申請日: 2015-04-29
• 公開（公告）號: CN105112498A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石超;馬翠萍;韓典昂;尚凡金;周美玲;王敬飛
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 陳磊;黃玉華

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種檢測地溝油的方法，尤其是一種利用外源動(dòng)物線粒體DNA檢測地溝油的方法。

技術(shù)背景：

“地溝油”又稱為潲水油、泔水油，是質(zhì)量、衛(wèi)生極差，過氧化值、酸值、水分、羰基價(jià)、丙二醛等指標(biāo)嚴(yán)重超標(biāo)的非食用油。其來源主要有：下水道中的油膩漂浮物；將賓館、酒樓的剩飯、剩菜經(jīng)過簡單加工、提煉出的油；用于油炸食品的油使用次數(shù)超過規(guī)定要求，或是劣質(zhì)豬肉、豬內(nèi)臟、豬皮加工以及提煉后產(chǎn)出的油。被撈回的“地溝油”通常會(huì)在勾兌一些新油之后流入食品、餐飲行業(yè)。地地溝油中重金屬、毒素(如丙烯醛、黃曲霉毒素)、過氧化值等都嚴(yán)重超標(biāo)，并含有洗滌劑等類化學(xué)雜質(zhì)，對人體具有很大危害性，食用后會(huì)引起嘔吐、頭痛、腹瀉等不良反應(yīng)，長期攝入會(huì)使細(xì)胞功能衰竭，甚至可成為癌變誘因。

目前，地溝油檢測的方法主要有以下幾種：1、根據(jù)酸價(jià)、過氧化值等理化指標(biāo)進(jìn)行檢測；2、根據(jù)地溝油中含有重金屬進(jìn)行檢測；3、根據(jù)地溝油中含有的動(dòng)物油脂，通過其膽固醇含量進(jìn)行檢測；4、利用電導(dǎo)率法進(jìn)行檢測；5、利用薄層色譜法對地溝油經(jīng)高溫加熱或反復(fù)使用后產(chǎn)生的極性物質(zhì)進(jìn)行檢測；6、利用熒光法檢測地溝油外源性污染物質(zhì)特性(餐具洗滌劑表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉)的特征熒光波峰為檢測對象進(jìn)行地溝油的檢測。

上述利用地溝油中的外源性物質(zhì)進(jìn)行檢測方法，由于檢測對象含量很少，同時(shí)該檢測對象無法被有效放大，因此檢測的靈敏度不高，準(zhǔn)確度不高。

現(xiàn)有技術(shù)中，也公開了一些克服上述不足的技術(shù)方案，主要是以地溝油中含有的外源性動(dòng)物DNA作為檢測對象，借助現(xiàn)有的核酸擴(kuò)增手段，有效放大核酸信號，提高了檢測的靈敏度及準(zhǔn)確度。

朱旭平等(專利CN101906471A)根據(jù)動(dòng)物線粒體CYTB基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，利用熒光定量PCR進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)果絕對Ct值進(jìn)行判定；郭新東等(專利CN102758025A)根據(jù)動(dòng)物物種牛、羊、豬、雞保守序列分別設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳產(chǎn)物進(jìn)行判定；鄧平建等(CN103290103A)利用PCR對豬、牛、雞、哺乳動(dòng)物等的看家基因進(jìn)行檢測，根據(jù)待檢油樣的擴(kuò)增DNA片段是否包含一個(gè)或多個(gè)物種特異性看家基因片段來判定。利用外源動(dòng)物DNA進(jìn)行檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高，但上述方法中利用結(jié)果絕對Ct值進(jìn)行判定，無法避免檢測過程中人員操作，環(huán)境等對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，判斷存在誤差，結(jié)果穩(wěn)定性不高；針對多個(gè)檢測靶標(biāo)設(shè)計(jì)多對引物，成本高，反應(yīng)體系復(fù)雜，結(jié)果判定不夠準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用外源動(dòng)物特征DNA檢測地溝油的方法，來解決現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高，穩(wěn)定性不好，準(zhǔn)確度低，成本高的問題。

一種利用外源動(dòng)物線粒體DNA檢測地溝油的方法，為對待檢油提取DNA后，以所提取的DNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增動(dòng)物線粒體DNA片段，所述動(dòng)物線粒體DNA片段的核苷酸序列為SEQIDNO:1。

為對待檢油提取DNA后，以所提取的DNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增植物葉綠體DNA片段，所述植物葉綠體DNA片段的核苷酸序列為SEQIDNO:2。

以植物葉綠體DNA片段擴(kuò)增結(jié)果為質(zhì)控線，所述質(zhì)控線用于檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否可用，以終濃度為10^-17M的動(dòng)物組織DNA標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為檢測限，當(dāng)待檢測油動(dòng)物線粒體DNA擴(kuò)增結(jié)果Ct值相對位置在檢測限前，即為地溝油。

所述待檢測油動(dòng)物線粒體DNA片段擴(kuò)增與所述植物葉綠體DNA片段擴(kuò)增在相同條件下，同時(shí)進(jìn)行。

所述動(dòng)物線粒體DNA片段的核苷酸序列SEQIDNO:1為：

GGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCT

所述植物葉綠體DNA片段的核苷酸序列SEQIDNO:2為：

GCACCCTAGATGGCGAGAGTCCAGTAGCCGAAAGCATCACTAGCTTACGCTCTGACCCGAGTAGCATGGGGCACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCAAGGACCACCTTGCAAGGCTAAATACTCCTGGGTGACCGATAGTGAAGTAGTACCGTGAGGGAAGGGTGAAAAGAACCCCCATCGGGGAGTGAAATAGAACATGAAACCGT

根據(jù)動(dòng)物線粒體DNA片段的核苷酸序列SEQIDNO:1獲得的動(dòng)物序列擴(kuò)增引物序列可以為：