[發明專利]一種海藻糖合酶的突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510210023.X
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN104789539B
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;張悅
• 申請（專利權）人: 湖南匯升生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P19/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 耿曉岳

技術領域

本發明涉及一種海藻糖合酶的突變體及其制備方法和應用，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

海藻糖是一種安全無毒以1,1-糖苷鍵構成的非還原性二糖，有三種異構體即(α,α)、異海藻糖(β,β)、新海藻糖(α,β)，一般以二水化合物的形式存在。與蛋白質或者氨基酸共同加熱，不會產生美拉德反應，并且在酸性、堿性、高溫、超低溫環境都能保持一定的穩定性。其獨特的生物活性，使得海藻糖得到廣泛的應用。大量的研究表明，海藻糖是單細胞生物、動物組織和器官、蛋白質、生物膜、醫藥制劑等的保護劑，能夠抑制脂質酸化、淀粉老化、蛋白質變性，具有矯味矯臭功能、搞玻璃轉化溫度、低吸濕性、低甜度等性質，能夠將其應用到醫藥業、農業、生化制品業、化妝品行業、食品加工業。

早期商業化的海藻糖是從酵母中提取的。1990年價格約700美元/kg，提取率過低，成本過高。1995年日本利用雙酶法實現工業化生產，使得海藻糖價格由原來的2萬日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg。中國2002年首次以雙酶法實現海藻糖的產業化，價格79元/kg。雙酶法以淀粉為原料，在麥芽寡糖基海藻糖水解酶和麥芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生產工藝復雜，難以推廣，目前全世界只有幾個公司能生產。而海藻糖合酶以麥芽糖為底物，一步轉化生成海藻糖，是相對經濟的生產方法，但仍有很多問題需要研究解決，其中海藻糖合酶是關鍵。因此，挖掘適合生產海藻糖的海藻糖合酶對于推動海藻糖的大規模工業化、降低產業成本具有重大的意義。

麥芽糖可以通過水解淀粉得到，生產過程中會產生一定的葡萄糖，工業化生產海藻糖使用純的麥芽糖成本過高。海藻糖合酶除了轉苷作用外還有微弱的水解反應，由此生成副產物葡萄糖。本發明所使用的來源于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶若以工業級的麥芽糖(含有1％-10％的葡萄糖)為底物，海藻糖合酶酶轉化率會受到一定的影響。本發明通過定點突變對海藻糖合酶進行改造，削弱葡萄糖對酶轉化的抑制作用。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種海藻糖合酶的突變體，其活性中心位點附近氨基酸發生突變，得到受葡萄糖抑制影響減弱的海藻糖合酶。所述突變體包括含有一個、兩個或三個相對于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶活性氨基酸殘基的取代。

所述海藻糖合酶的親本的氨基酸序列與NCBI數據庫中的Thermobifida fusca YX海藻糖合酶一致(登錄號WP_011291031.1)。

所述突變體是將親本海藻糖合酶的第289位的谷氨酸(Glu)突變為甘氨酸(Gly)，命名為E289G；或將第295位的組氨酸(His)突變成天冬酰胺(Asn)，所得突變體命名為H295N；或將第344位的甲硫氨酸(Met)突變成賴氨酸(Lys)，所得突變體命名為M344K；或將第367位的甲硫氨酸(Met)突變成亮氨酸(Leu)，所得突變體命名為M367L。

所述突變體還可以是將單突變體酶H295N中第289位的谷氨酸(Glu)突變為甘氨酸(Gly)，所得突變體命名為H295N/E289G；或將單突變體酶H295N中第344位的甲硫氨酸(Met)突變成賴氨酸(Lys)，所得突變體命名為H295N/M344K；或將單突變體酶H295N基因中第367位的甲硫氨酸(Met)突變成亮氨酸(Leu)，所得突變體命名為H295N/M367L。

所述突變體還可以是將雙突變體酶H295N/M344K基因中第367位的谷氨酸(Met)突變成亮氨酸(Leu)，所得突變體命名為H295N/M344K/M367L。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種受葡萄糖抑制影響減弱的海藻糖合酶突變體的制備方法，包括如下步驟：

(1)在Thermobifida fusca YX海藻糖合酶氨基酸序列的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物，以攜帶海藻糖合酶基因的載體為模板進行定點突變；構建含突變體的質粒載體；

(2)將突變體質粒轉化進宿主細胞；

(3)挑選陽性克隆進行發酵培養，并純化獲得海藻糖合酶突變體。

在本發明的一種實施方式中，所述質粒載體為pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一種。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主細胞為細菌或真菌細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述的細菌為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。